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摘要

复杂生物系统的可编程组装是生物学研究的长期目标。生成式建模提升了计算设计的可靠性，但现有方法高度专业化，难以拓展或组合。本文提出面向生成生物学的高级编程语言Proto。通过将少量抽象原语组合为结构化程序，可实现跨模态、跨尺度的生成式设计任务，覆盖DNA、RNA、蛋白质、配体及其相互作用。Proto可便捷地将预测模型整合至生成工作流中，本文基于该框架设计了可变剪接内含子，并在人类细胞系中完成实验验证。Proto原生支持多目标优化，可用于设计启动子-阻遏子对，在合成蛋白-DNA设计领域取得了领先的实验成功率。结合AI智能体，Proto可通过自然语言指令实现复杂通路与调控逻辑的定义。本文开源发布Proto全套工具，包括软件基础设施与用户界面，以推动生成式生物编程的广泛应用。

brianhie@stanford.edu

#生成生物学 #可编程生物设计 #高级编程语言 #多模态生成模型 #多目标优化 #AI智能体

引言

图1Proto系统概述

(A) Proto整合DNA、RNA、蛋白质、配体及其相互作用的生成式与预测模型，并与功能持续升级的大语言模型、AI编程智能体联动，通过组件组合实现多目标、多模态、多尺度的生物设计。

(B) Proto在功能与语义层面定义模块化与组合性，借助生成式建模在抽象层级与底层生物序列间搭建桥梁，同时保证全局功能一致性；与之相对，传统生物编程依靠直觉、启发式规则或试错拼接具象序列元件，设计鲁棒性较差。

(C) Proto语言的4类原语——序列、约束、生成器、优化器，对应自然与实验生物设计中的同类概念，同时可表述为能量基模型的组成因子，对应目标分布π(x)∝p(x)exp(−f(x)/T)，其中y=f(x)。

(D) Proto中，生成器提出候选序列，约束对序列打分，优化器引导生成向低能量（更优）设计收敛；Proto还提供高层交互接口，包括Python应用程序接口（本地库与云端托管版）、图形用户界面，以及对接通用AI编程智能体的智能体接口。

(E) Proto整体工作流：将生物设计任务编码为1组与序列关联的约束和生成器，优化算法组合各生成模型，将全部约束编译为统一能量函数，最终输出设计完成的序列集合。

结果

Proto复现已发表设计任务

图2基于Proto编程实现多样化设计任务

(A−C) 从头设计对称蛋白同源寡聚体：以均匀突变为生成器，ESMFold预测结构的置信度、对称性、球形度为约束，Metropolis-Hastings模拟退火为优化器（A为程序示意图；B为优化轨迹），最终得到3聚体到8聚体的预测对称组装体(C)。

(D−F) 基于Protein Hunter的从头蛋白单体设计：交替执行Boltz-2结构预测（约束）与ProteinMPNN序列重设计（生成器），采用循环优化器(D)，设计随循环迭代收敛至高结构置信度 (E, F)。

(G−I) 多模态CRISPR-Cas系统设计：以微调后的Evo 1为生成器，生物信息学过滤与结构预测为约束，采用拒绝采样流程筛选候选序列(G, H)；从48,000条采样基因座中得到40条合格设计，包含推定的Cas9蛋白与向导RNA (I)。

(J−L) 多千碱基级染色质可及性设计：以Evo 2为自回归生成器，Enformer与Borzoi为可及性约束，集束搜索算法为优化器 (J, K)，得到1条20 kb的DNA序列，预测整合入小鼠基因组后可编码摩尔斯电码PROTO，AUROC=0.98(L)。

(M−O) 基于Germinal的从头抗体互补决定区设计：对AlphaFold 2结构损失与AbLang抗体语言模型损失做多目标优化，以梯度下降为优化器(M, N)，最终得到VHH与scFv骨架的PD-L1结合剂，AlphaFold 2置信度较高（pLDDT >0.8，ipTM >0.6）(O)。

细胞系特异性基因调控的内含子设计

图3基于Proto设计人类细胞系中的可变剪接内含子

(A) 以SpliceTransformer供体-受体打分、AlphaGenome细胞系特异性为约束，在多种质粒与人类基因组背景下评估以降低上下文依赖变异；每轮生成中，均匀突变生成器在组成型剪接内含子或随机初始序列上提出突变，MCMC优化器决定是否接受提议。

(B) 归一化能量（能量总分除以约束数量）随优化迭代的变化曲线；所有设计方向（SH-SY5Y正确剪接/K562错剪、SH-SY5Y错剪/K562正确剪接、HepG2正确剪接/K562错剪、HepG2错剪/K562正确剪接）的轨迹均收敛。

(C) 两两相似度评分证实，实验测试的设计内含子在组内与组间均保持序列多样性。

(D) 脱靶细胞中内含子滞留会封闭下游效应元件，靶细胞中内含子切除则可启动效应蛋白翻译。

(E) 筛选ProtoIntron的质粒构建示意图：将ProtoIntron插入mScarlet编码序列，下游带恒定条形码用于异构体定量，采用双报告载体，eGFP由EF1α独立驱动；成功剪接可恢复全长mScarlet的翻译。

(F) 通过RNA测序对转染细胞系的异构体比例与剪接变异度进行定量。

(G) 各构建体的剪接产物比例热图，证实多组细胞系组合、多种设计方向下均存在细胞差异性剪接。PI为ProtoIntron缩写。

(H) 代表性差异剪接内含子的AlphaGenome预测剪接位点使用率，与实测的隐蔽剪接、经典剪接事件吻合度较高，而预测RNA表达量偏差相对更大。

(I) 荧光显微镜测得的mScarlet/eGFP比值，整体验证了蛋白水平的差异性效应元件翻译。S为SH-SY5Y，K为K562，H为HepG2；PC为HBB2c内含子阳性对照；NC为反向HBB2c内含子阴性对照。

(J) 代表性荧光显微图像，展示不同设计组中mScarlet表达的细胞系特异性差异。

合成启动子-阻遏子相互作用设计

图4基于Proto设计合成启动子-阻遏子对

(A) ProtoPromoter生成流程：第1阶段使用Evo 2与拒绝采样生成候选启动子序列，筛选指标包括预测启动子活性、σ70盒质量、无天然转录因子基序，以优化启动子强度与正交性；第2阶段通过均匀突变与MCMC优化器精炼序列，并引入回文操纵子位点。

(B) ProtoRepressor生成流程：第1阶段使用Evo 2与天然序列，经拒绝采样筛选出AlphaFold 3、Boltz-2预测结合活性达标的初始阻遏子序列；第2阶段采用LigandMPNN与拒绝采样，评估基序接触、Rosetta蛋白-DNA结合指标；第3阶段通过LigandMPNN与MCMC优化精炼结合界面，引入NA-MPNN、DeepPBS、AlphaFold 3特异性指标提升靶向特异性。

(C) 设计的ProtoPromoter与天然σ70启动子的序列标识图，展示−35与−10盒的保守性。

(D) 天然序列、ProtoPromoter、随机打乱序列与σ70启动子的序列一致性分布；ProtoPromoter 多样性高，与天然σ70启动子序列相似度低。

(E) 细菌eGFP报告实验示意图，用于ProtoPromoter功能筛选；ProtoPromoter克隆至eGFP上游，以荧光强度表征转录活性。

(F) ProtoPromoter的eGFP表达倍数排序；虚线标注J23119组成型启动子强度、10倍变化阈值、PLtetO1强度与无启动子阴性对照；ProtoPromoter整体活性强，多数表达倍数超10倍，最强启动子与J23119相当或接近。

(G) 综合设计能量与eGFP倍数呈中度负相关，验证了多目标打分函数对活性启动子的筛选能力。误差线为均值标准误。

(H) ProtoRepressor筛选实验示意图：功能性ProtoPromoter驱动eGFP表达作为报告系统，候选阻遏子由独立的阿拉伯糖诱导型启动子表达；功能性阻遏子会抑制启动子活性、降低eGFP水平，无功能变体则不影响eGFP表达。

(I) 14个ProtoPromoter对应的实验筛选阻遏子最高BLAST氨基酸序列一致性分布，表明生成的阻遏子序列新颖性高；纵轴为随机抖动值；ProtoRep家族指靶向同一ProtoPromoter的阻遏子候选集。

(J) 流式细胞术测得的各启动子-阻遏子组合的log2倍数抑制效果，颜色区分阻遏子家族；多数阻遏子相对阴性对照均有显著抑制效果。误差线为均值标准误。Ctrl为tetR阳性与非靶向对照；NS为相对倍数= 1无显著性。

(K) 顶级阻遏子候选在单操纵子、双操纵子构型下的抑制倍数；增加第2个操纵子位点可提升抑制强度，对照为组成型λ阻遏子cI、tetR与非靶向tetR对照。##表示与cI相比P<0.01；**表示与tetR相比P<0.001。柱形为均值，圆点为独立重复。

(L) 交叉抑制热图，展示候选阻遏子对同源与非同源启动子的log2倍数抑制效果；强阻遏子普遍对靶标启动子具有特异性。

(M) ProtoRepressor 40_2与44_9的蛋白-DNA复合物AlphaFold 3预测结构，内嵌图展示识别螺旋插入DNA大沟，形成碱基与骨架接触。

复杂生物系统的智能体编程

图5AI智能体辅助实现复杂生物设计的Proto编程

(A) 可人机交互的通用AI编程智能体，能将自然语言调控指令转化为Proto程序，既帮助领域知识有限的用户编写基础程序，也拓展了专业用户可实现的设计复杂度。

(B−D) 蛋白质组规模的复合物多样化改造。

(B) 多样化模块示意图：以野生型人类序列为各亚基种子，ESM3提出变体，以各亚基的结构置信度（ESMFold pLDDT/pTM）、折叠一致性（TM-score、相对天然结构的RMSD）、序列复杂度为约束，运行联合MCMC优化器，最终由AlphaFold 3对完整多聚体打分。

(C) 有已知实验结构的设计复合物，其AlphaFold 3预测结构相对天然结构的RMSD（中位数1.9 Å）、TM-score（中位数0.80），以及AlphaFold 3结构置信度pTM（中位数0.65）、pLDDT（中位数71）的分布。

(D) 代表性AlphaFold 3预测复合物及功能类别标注，展示本次多样化改造的规模。

(E−K) β2肾上腺素信号通路的重设计。

(E) 通路示意图，涵盖β2AR、Gαβγ、腺苷酸环化酶、PKA、CREB1与CREB响应DNA元件，在ESM3/AlphaFold 3多样化基础模块上叠加功能特异性约束；肾上腺素、ATP、CBP、CREB DNA背景等无生成器的元件在优化中保持固定。

(F) β2AR-Gs复合物（上）、结合肾上腺素的β2AR（下）的AlphaFold 3预测结构，与实验结构比对。

(G) BioEmu构象集成分析显示，设计的Gαs可占据2种已知天然构象。

(H) Gαs-腺苷酸环化酶复合物（上）、结合ATP的腺苷酸环化酶（下）的预测结构与实验结构比对。

(I) 设计的PKA调节亚基可占据2种天然构象。

(J) PKA调节亚基与催化亚基异2聚体的预测结构与实验结构比对。

(K) 上图为ESM3多样化的CREB1、Evo 2生成的DNA、天然 CBP形成的复合物预测结构，与CREB1-DNA、CREB1-CBP天然互作结构比对；下图为Borzoi预测的Evo 2生成DNA元件上的CREB1 ChIP-seq信号。

(L−R) 非小细胞肺癌选择性治疗效应元件。

(L) 多层级慢病毒门控策略设计：EGFR靶向微型蛋白结合剂介导病毒优先进入肿瘤细胞，NSCLC特异性增强子与启动子驱动HSV-TK转录，内嵌内含子实现HSV-TK的NSCLC选择性剪接，3'UTR微RNA应答元件阵列抑制脱靶细胞的残留表达。

(M) 包含5个设计阶段的Proto程序：

① EGFR胞外域微型蛋白结合剂设计；

② NSCLC特异性增强子设计；

③ NSCLC特异性启动子设计；

④ NSCLC选择性内含子设计；

⑤ 3'UTR开关设计，约束涵盖结构置信度、表观基因组活性、启动子信号、剪接位点使用率、微RNA介导抑制。

(N) 设计的EGFR结合微型蛋白与EGFR胞外域复合物的AlphaFold 3预测结构，显示高结构置信度与多处界面接触。

(O) AlphaGenome预测设计增强子在A549与健康肺组织的H3K27ac、H3K4me1信号（GAPDH整合背景），显示增强子活性具有A549偏向性。

(P) AlphaGenome预测设计启动子在A549与健康肺组织的H3K4me3、CAGE、Puffin启动子活性；CAGE与Puffin显示启动子末端存在转录起始位点，健康肺组织活性更低。

(Q) AlphaGenome预测的NSCLC选择性HSV-TK内含子剪接位点使用率与RNA-seq信号，显示A549中内含子切除倾向略高于健康肺组织。

(R) 设计的3'UTR关闭开关，健康肺组织中TargetScan与miRanda预测的微RNA结合位点活性更强，同时避开NSCLC高表达微RNA靶点，且AlphaGenome预测选定微RNA应答元件处RNA信号较低。

数据、代码

Proto语言实现与Python应用程序接口

https://github.com/evo-design/proto-language

Proto工具层实现与Python应用程序接口

https://github.com/evo-design/proto-tools

Proto网页交互界面可访问

https://proto.evodesign.org/

详细总结

思维导图

参考

A high-level programming language for generative biology with Proto

doi: https://doi.org/10.64898/2026.06.22.733870

260623Proto.pdf

注：AI辅助创作，如有不当欢迎指出。内容仅供参考，不构成任何建议。