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1. 从“拍脑袋”到“有章法”：为什么微生物数据分析必须重视统计检验？

在实验室里泡了十几年，从最早的手工划线、镜检计数，到如今动辄TB级的宏基因组数据，我最大的感触就是：微生物研究，尤其是组学时代的研究，已经从一门“描述性”的艺术，越来越变成一门“定量化”的科学。早些年，我们可能比较两个样本的菌群丰度，看一眼柱状图，感觉“这个高，那个低”，就敢下结论。但现在，面对成百上千个OTU/ASV，几十上百个样本分组，如果还靠肉眼观察和直觉判断，那无异于在数据海洋里“盲人摸象”，结论的可靠性根本无从谈起。

这就是统计检验的价值所在。它本质上是一套“方法论”和“裁判规则”，帮助我们回答一个核心问题：我们观察到的差异（比如处理组某菌丰度升高），有多大可能是随机波动造成的假象，又有多大把握能归因于真实的实验效应？没有这套规则，任何差异都只是“看起来不同”，无法上升到科学的、可重复的结论层面。因此，无论是比较两组小鼠肠道菌群的差异，还是分析不同施肥条件下土壤微生物的功能基因变化，选择合适的统计检验方法是得出可靠结论的第一步，也是最容易“踩坑”的一步。

很多人觉得统计枯燥难懂，面对T检验、ANOVA、非参数检验、多元分析等一堆名词就头大。其实，我们不需要成为统计学家，但必须成为“统计方法的选择者”。这就好比你要拧螺丝，不需要精通螺丝的锻造工艺，但必须能分辨出该用十字螺丝刀还是一字螺丝刀。选错了工具，要么根本拧不动，要么会把螺丝拧花，得出错误结论。本文的目的，就是结合我处理大量微生物（包括扩增子、宏基因组、培养组）数据的实战经验，帮你理清这些“螺丝刀”的适用场景、使用前提和常见陷阱，让你在面对数据时，能从“拍脑袋”选择，进化到“有章法”应用。

2. 微生物数据的两大特征：如何决定了统计检验的“起手式”？

在选择具体的检验方法之前，我们必须深刻理解微生物数据，特别是高通量测序产生的丰度数据，有哪些“天生”的特性。这些特性直接限定了我们统计工具箱里哪些工具能用，哪些需要谨慎使用或调整。

2.1 特征一：组成性数据——相对丰度的“跷跷板”效应

这是微生物组数据最核心、也最容易被忽视的特征。我们得到的OTU/ASV表格，每一行是一个物种，每一列是一个样本，单元格里的值通常是序列数。我们通常将其转化为相对丰度（即每个样本中，各物种的读数占总读数的百分比）。关键问题来了：所有物种的相对丰度之和，对每个样本来说恒定为100%（或1）。这意味着任何一个物种丰度的增加，都必然导致其他一个或多个物种丰度的相对减少，数据点之间不是独立的，而是存在一种固有的负相关约束。

这会产生什么后果？假设我们比较健康和疾病两组人的肠道菌群，发现疾病组中病原菌A的相对丰度显著上升。这个“上升”，可能由三种情况导致：

1. 真实增长：A菌的绝对数量确实增多了。
2. 相对凸显：A菌数量没变，但其他有益菌（如B菌）数量大幅减少，导致A菌的比例被动升高。
3. 混合效应：上述两者兼有。

传统的、针对绝对丰度设计的统计方法（如许多参数检验），直接应用于相对丰度数据，可能会产生误导性结果。因为它无法区分这种“跷跷板”效应。因此，在处理组成性数据时，我们有几种策略：

• 策略A：使用针对组成性数据设计的检验方法。例如，基于中心对数比变换的一系列方法。ALDE/2、ANCOM等工具的核心思想就是通过巧妙的变换，消除总和约束，使数据适用于常规的统计检验框架。
• 策略B：关注多样性指数而非单一物种。Alpha多样性（如Shannon指数）和Beta多样性距离（如Bray-Curtis、UniFrac）是从整体层面概括群落结构的指标，受组成性影响的方式不同，有时更稳健。
• 策略C：在解释单一物种差异时，保持高度警惕。永远要将显著差异的物种放在整个群落变化的背景下去理解，结合生态学知识进行推断，而不是孤立地看待p值。

2.2 特征二：稀疏性与过离散——当数据“又少又不听话”

微生物测序数据第二个显著特征是“稀疏性”。即使测序深度很高，对于一个特定样本而言，绝大多数物种的计数都是0或非常小的整数（比如1，2，3）。这是因为自然界中微生物种类极多，但单个样本的承载量和测序量有限。稀疏性导致数据不符合许多参数检验（如T检验、ANOVA）所要求的正态分布假设。

与稀疏性相伴而生的是“过离散”。简单说，就是数据的实际方差远大于理论期望的方差（例如泊松分布期望的方差等于均值）。在微生物数据中，由于生物异质性（样本间差异天然很大）和技术噪音，同一个处理组内不同样本的物种计数波动，通常会比简单的泊松分布所预测的要大得多。

稀疏性和过离散共同作用，使得直接将适用于连续正态数据的经典统计方法（如基于正态分布的T检验）应用于原始的物种计数数据，其效力会大打折扣，甚至得出错误结论。

应对策略：

• 策略A：采用基于分布的模型。使用专门为计数数据、并能处理过离散问题设计的统计模型。最经典的就是负二项分布模型，它通过引入一个额外的离散度参数来拟合方差大于均值的情况。例如，DESeq2（来自转录组分析，但广泛应用于微生物）和 edgeR 等工具的核心就是负二项分布检验。对于零特别多的数据，还可以考虑零膨胀模型。
• 策略B：非参数检验。当数据分布严重畸形，或者我们不想对数据分布做任何假设时，非参数检验是强有力的工具。如Mann-Whitney U检验（两组比较）或Kruskal-Wallis H检验（多组比较）。它们不依赖于具体的分布形式，只关心数据的秩次。缺点是当数据确实符合某些分布时，其统计检验力可能低于对应的参数检验。
• 策略C：适当的数据转换。对于某些分析（如基于距离的多元分析），可以对计数数据进行转换，以减轻稀疏性和异方差的影响。常用的转换包括：
  • 对数转换：log1p(x) = log(x+1)，可以压缩数据的动态范围，使大值和小值的差异相对变小，更接近正态分布。但需注意，加1是人为的，对于零很多的数据效果有限。
  • 平方根转换：sqrt(x)，效果比对数转换温和。
  • CSS标准化后转换：如metagenomeSeq提出的CSS标准化，旨在更有效地处理稀疏性。

注意：数据转换是一种“调和”手段，目的是让数据满足后续分析方法的前提假设。它改变了数据的原始尺度，因此在解释结果时，要牢记你是在解释转换后的数据差异。

理解了这两大特征，我们就能明白，为什么在微生物数据分析中，很少能“一招鲜吃遍天”，而需要根据具体问题、数据类型和假设条件，在多种统计工具中做出明智选择。下面我们就进入实战选择环节。

3. 单变量分析：如何比较一个指标在不同组间的差异？

单变量分析是微生物组研究中最常见的问题：我们想比较一个特定的指标（例如：某个特定物种的丰度、Alpha多样性指数、某个功能基因的拷贝数）在两个或多个组之间是否存在显著差异。这是假设检验最直接的应用场景。

3.1 场景一：两组比较（如疾病组 vs. 健康组）

这是最简单的比较。选择哪种方法，主要取决于数据的分布特征和样本量。

1. 参数检验之选：Student‘s t检验

• 适用条件：待比较的指标（如Shannon指数）近似服从正态分布，并且两组数据的方差齐性（即波动程度差不多）。样本量通常建议每组不少于5-10个（样本量越大，对正态性的要求可以适当放宽）。
• 微生物数据实战要点：
  • Alpha多样性指数：像Shannon、Chao1这样的指数，在样本量足够大（如n>20）时，其分布通常接近正态，可以直接使用t检验。但务必先做正态性检验（如Shapiro-Wilk检验）和方差齐性检验（如F检验或Levene检验）。
  • 物种丰度：绝对不要对原始的物种计数或相对丰度直接做t检验！因为它们几乎从不满足正态分布。必须经过前述的模型（如负二项检验）或转换（如log转换）处理后再考虑。
• 操作与解读：

  # R语言示例：检验两组样本的Shannon指数差异 # 假设 df 为数据框，包含分组信息‘group’和多样性指数‘shannon’ # 1. 正态性检验（以组为单位） shapiro.test(df$shannon[df$group == "Healthy"]) shapiro.test(df$shannon[df$group == "Disease"]) # 2. 方差齐性检验 var.test(shannon ~ group, data = df) # 3. 若满足条件，进行t检验 t.test(shannon ~ group, data = df, var.equal = TRUE) # 若方差齐 t.test(shannon ~ group, data = df, var.equal = FALSE) # 若方差不齐（Welch‘s t检验）

  结果解读：重点关注p值。通常p < 0.05认为差异显著。但更重要的是结合效应量（如Cohen‘s d）来判断差异的生物学意义。一个p值显著但效应量极小的差异，可能并无实际价值。

2. 非参数检验之选：Mann-Whitney U检验（Wilcoxon秩和检验）

• 适用条件：当数据不满足正态分布，或者样本量很小，或者数据是等级资料时。这是微生物数据分析中使用频率最高的两组比较方法，因为它稳健、不挑剔分布。
• 微生物数据实战要点：
  • 物种丰度比较：这是它的主战场。直接对物种的原始计数或相对丰度进行秩和检验，是快速筛选差异物种的常用方法。虽然从理论严谨性上，不如负二项模型，但在很多探索性分析中非常实用。
  • 多样性指数：当正态性假设不满足时，用它来替代t检验。
• 操作与解读：

  # R语言示例：使用Wilcoxon检验比较两组物种丰度 # 假设 abundance 是某物种在两组样本中的丰度向量 wilcox.test(abundance ~ group, data = df, exact = FALSE) # exact=FALSE用于大样本近似

  结果解读：它检验的是两组数据的分布位置是否相同。p值小于0.05表示有理由认为两组的分布中心（中位数）不同。注意，它比较的是中位数，而非均值。

3. 针对计数数据的模型：负二项检验（如DESeq2/edgeR）

• 适用条件：专门为原始测序计数数据设计，能有效处理过离散问题。这是目前进行组间差异物种分析最受推荐、也最严谨的方法之一。
• 实战流程：
  1. 输入：原始的OTU/ASV计数表格，以及样本分组信息。
  2. 标准化：DESeq2等工具内部会进行基于几何均数的标准化（如DESeq2的median-of-ratios方法），以消除测序深度差异的影响。切记，不要自己先做一次标准化（如转化为相对丰度）再输入。
  3. 拟合与检验：工具会为每个物种拟合一个负二项广义线性模型，并检验分组变量系数的显著性。
• 优势：模型基础牢固，考虑了计数数据的特性，检验效力高。同时能输出经过多重检验校正后的p值（padj），以及差异倍数（Fold Change）。
• 代码示意：

  # R语言 DESeq2 流程简示 library(DESeq2) # dds 为DESeqDataSet对象，包含计数矩阵和样本信息 dds <- DESeq(dds) # 进行差异分析 res <- results(dds, contrast=c("group", "Disease", "Healthy")) # 提取结果 # res对象中包含了log2FoldChange, pvalue, padj等关键信息

3.2 场景二：多组比较（如不同时间点、不同处理浓度）

当组别超过两个时，我们不能简单地进行两两t检验，这会急剧增加犯第一类错误（假阳性）的概率。需要用到方差分析或其非参数对应方法。

1. 参数检验之选：单因素方差分析

• 适用条件：与t检验类似，要求数据满足正态性和方差齐性，且各组独立。
• 微生物实战：常用于比较多个组别的Alpha多样性指数。同样需要先进行正态性和方差齐性检验。
• 事后检验：如果ANOVA得出p<0.05，只说明“至少有两组之间存在差异”，但不知道具体是哪两组。需要进一步进行“事后多重比较”，如Tukey‘s HSD（最常用）、Bonferroni校正等。

  # R语言示例 aov_result <- aov(shannon ~ treatment, data=df) # 方差分析 summary(aov_result) TukeyHSD(aov_result) # Tukey事后检验

2. 非参数检验之选：Kruskal-Wallis H检验

• 适用条件：多组独立样本，数据不满足正态分布或为等级资料。是Mann-Whitney U检验的多组推广。
• 微生物实战：用于多组间的物种丰度或多样性指数比较。同样，如果总体检验显著，需要进行事后两两比较（如Dunn检验，并配合Bonferroni等校正）。

  kruskal.test(abundance ~ treatment, data=df) # K-W检验 # 事后比较可使用‘dunnTest’函数（来自FSA包）

3. 复杂设计：多因素方差分析/混合效应模型

• 适用条件：当实验设计包含多个影响因素时。例如，研究“药物处理”（A因素）和“饮食类型”（B因素）对菌群的影响，以及两者之间是否存在交互作用。
• 微生物实战：在微生物实验中非常常见。例如，同一个体在不同时间点的采样（重复测量），就需要使用重复测量方差分析或线性混合效应模型，将个体差异作为随机效应纳入模型，才能正确评估处理效应。

  # 示例：线性混合效应模型（lme4包），考虑个体‘subject’作为随机效应 library(lme4) lmer(shannon ~ treatment * time + (1|subject), data=df)

个人心得：单变量检验的“流水线”选择策略面对一组数据，我通常按以下流程决策：

1. 看数据本质：如果是原始测序计数，首选负二项模型（DESeq2/edgeR）。这是最“正宗”的方法。
2. 看分布：如果是衍生指标（如多样性指数），先做正态性检验。若符合，用t检验/ANOVA；若不符合，直接用非参数检验（Wilcoxon/Kruskal-Wallis）。在微生物领域，数据“不正常”是常态，所以非参数检验是我的“默认备选”。
3. 看样本量：样本量极小（如n<5）时，任何检验的效力都很低。此时非参数检验或精确检验可能更合适，但更重要的是承认结果的探索性，不要过度解读。
4. 永远记住事后校正：只要做了多次比较（包括多组事后比较、多个物种的检验），就必须进行多重检验校正（如FDR/BH校正），控制假阳性率。DESeq2的padj、p.adjust(p, method="BH")是你的好朋友。

4. 多变量分析：如何整体比较微生物群落结构的差异？

单变量分析是“逐个击破”，而多变量分析是“整体观照”。它的核心问题是：不同组别的样本，其整体的微生物群落结构是否显著分离？这通常通过Beta多样性分析来实现。

4.1 核心思想：从距离矩阵到统计检验

多变量分析的第一步，是计算所有样本两两之间的生态距离，形成一个距离矩阵。常用的距离包括：

• Bray-Curtis：基于丰度的差异，对物种有无和丰度都敏感，最常用。
• Jaccard：只关心物种有无（0/1），忽略丰度信息。
• UniFrac：包含系统发育信息，分为未加权（只考虑有无）和加权（同时考虑丰度）。

得到距离矩阵后，我们可以通过可视化（如PCoA、NMDS）直观地看样本是否按组别聚类。但视觉判断是主观的，需要统计检验来定量评估组间差异的显著性。

4.2 检验方法一：置换多元方差分析

这是微生物生态学中最主流、最强大的多变量差异检验方法。

• 原理：它的思想类似于ANOVA，但应用于多元数据。它通过比较组间距离的方差与组内距离的方差的比值（F值）来判断组间差异是否大于随机期望。
• 关键步骤：为了得到p值，PERMANOVA采用置换检验。即随机打乱样本的分组标签成百上千次，每次计算一个伪F值，形成一个伪F值的分布。然后看真实F值在这个分布中的位置（百分位数），从而计算出“随机置换得到比真实F值更大结果的概率”，这就是p值。
• 优势：可以处理任何距离矩阵，不要求数据满足多元正态分布，非常灵活。
• 局限与注意事项：
  1. 对离散度的敏感度：PERMANOVA的零假设是“组间距离的分布中心相同”。但如果各组样本的离散度（方差）差异很大，即使中心位置相同，也可能得到显著的p值。这就是“方差不齐”在多变量中的体现。
  2. 必须配合相似性分析检验：因此，做PERMANOVA之前或之后，必须进行相似性分析检验。它专门检验组内离散度是否同质。如果PERMANOVA显著而ANOSIM不显著，且PERMANOVA的R²值很小，需要警惕可能是离散度差异造成的假阳性。
• 实战操作：

  # R语言 vegan包示例 library(vegan) # adonis2 是执行PERMANOVA的函数 # df_dist 是Bray-Curtis距离矩阵，metadata$Group是分组因子 permanova_result <- adonis2(df_dist ~ Group, data = metadata, permutations = 999) print(permanova_result) # 查看R²和p值 # 进行相似性分析检验 beta_disp <- betadisper(df_dist, metadata$Group) permutest(beta_disp) # 检验组间离散度差异

4.3 检验方法二：相似性分析

• 原理：计算所有样本对的距离后，它比较组内距离和组间距离的差异。通过置换检验，判断观察到的组内相似性是否显著高于随机分组下的期望。
• 特点：比PERMANOVA更早被广泛使用，但其统计效力被认为通常低于PERMANOVA。它对距离矩阵的类型没有特殊要求。
• 实战操作：

  anosim_result <- anosim(df_dist, metadata$Group, permutations = 999) summary(anosim_result) plot(anosim_result)

  结果解读：R值介于-1到1之间。R>0表示组内相似性大于组间；R=0表示随机分组；R<0表示组内差异大于组间（罕见）。p值判断显著性。

4.4 如何选择与报告？

1. 标准流程：对于大多数基于距离矩阵的群落差异分析，PERMANOVA是首选。但必须同时报告相似性分析检验的结果，以验证组内离散度同质的前提是否满足。
2. 结果报告：在论文中，不应只说“PCoA图显示组间分离”。必须附上统计检验结果，例如：“基于Bray-Curtis距离的PERMANOVA分析表明，处理组与对照组间微生物群落结构存在显著差异（R² = 0.15， p = 0.001）。相似性分析检验显示组内离散度同质（p = 0.25），支持PERMANOVA结果的可靠性。”
3. 复杂设计：adonis2函数也支持多因素模型和交互项，例如adonis2(dist ~ Treatment * Time + Block, data=metadata)，可以分析更复杂的实验设计。

踩坑实录：PERMANOVA的“伪显著”我曾分析一组数据，发现抗生素处理组和对照组的PERMANOVA结果极其显著（p<0.001），R²也很高。但查看PCoA图时，虽然两组有分离趋势，但组内特别是对照组的点非常分散。我立刻做了相似性分析检验，结果发现两组离散度差异极显著（p<0.01）。这意味着，PERMANOVA的显著性很可能部分源于对照组内部变异极大，而非两组中心位置的稳定偏移。最终，我在文章中谨慎地报告了这一结果，并强调了对照组个体差异大的生物学意义，而不是简单地宣称抗生素产生了强烈效应。这个教训让我养成了“PERMANOVA + 相似性分析检验”的固定组合拳习惯。

5. 相关性分析与网络构建：如何挖掘物种间的共现关系？

微生物很少孤立存在，它们之间存在着复杂的相互作用（共生、竞争、捕食等）。相关性分析旨在从观测数据中推断这些关系的模式，是构建微生物生态网络的基础。

5.1 方法选择：从简单到复杂

1. 经典线性相关：Pearson与Spearman

• Pearson相关：衡量两个连续变量之间的线性相关程度。要求数据大致服从二元正态分布，且关系是线性的。
• Spearman秩相关：衡量两个变量之间的单调相关程度（一个变量增加时，另一个变量倾向于增加或减少，但不一定是直线）。它基于数据的秩次，对异常值不敏感，不要求正态分布。
• 微生物实战选择：由于物种丰度分布极端不均且多零值，Spearman相关是更稳健、更常用的选择。直接应用于物种间的相对丰度或转化后的数据。
• 局限：它们计算的是两两之间的相关性，忽略了其他物种的影响。可能将间接相关（如A和B都受C影响）误判为直接相关。

2. 偏相关分析：控制混杂因素

• 原理：在计算A和B的相关性时，将其他一个或多个变量（Z）的影响“控制住”或“剔除掉”。这有助于发现更可能是直接作用的关联。
• 挑战：在微生物网络中，要控制所有其他物种的影响计算偏相关，计算量巨大，且在高维（物种数远大于样本数）情况下，矩阵求逆不稳定，结果不可靠。

3. 专门为成分数据设计的方法：SparCC与REBACCA

• SparCC：专门为组成性数据设计。它通过迭代逼近，估算物种间的对数比方差，从而推断相关性，能在一定程度上缓解组成性带来的虚假相关问题。
• REBACCA：基于分位数回归，对组成性数据有较好的鲁棒性。
• 使用建议：当怀疑组成性效应（“跷跷板”效应）可能主导相关信号时，可以优先尝试SparCC。但其计算较慢，且对于特别稀疏的数据，表现也会下降。

4. 基于回归模型的网络推断：MEN/SPIEC-EASI

• 这是当前更为先进和推荐的方法。它将微生物网络推断问题转化为高维变量选择问题。
• 原理：假设每个物种的丰度可以表示为其他物种丰度的线性函数（或经过某种链接函数变换）。通过回归模型（如LASSO、弹性网络）来拟合，只有那些回归系数不为零的物种对，才被认为存在边（关联）。SPIEC-EASI 是该框架下的一个著名工具集。
• 优势：
  • 能更好地区分直接相互作用和间接关联。
  • 通过正则化（如LASSO）处理高维小样本问题，防止过拟合。
  • 可以生成更稀疏、更可信的网络。
• 挑战：计算复杂，需要调参（如正则化强度λ的选择），对样本量要求相对较高。

5.2 实战流程与陷阱规避

构建一个相关网络，远不止计算一个相关矩阵那么简单。以下是关键步骤和心得：

步骤1：数据预处理与过滤

• 绝对不要用所有物种：大量低频、稀疏的物种（在大多数样本中为零）会引入大量噪声，并导致相关性计算不稳定（例如，两个极少出现的物种，可能因为偶然在同一个样本中出现一次而产生极高的虚假相关）。
• 过滤策略：通常保留在至少一定比例（如20%）的样本中出现的物种，或者根据总丰度排名保留前N个物种。过滤阈值需要根据数据情况权衡。

  # 示例：过滤掉在少于10%样本中出现的物种 prevalence_threshold <- 0.1 * ncol(otu_table) otu_filtered <- otu_table[rowSums(otu_table > 0) >= prevalence_threshold, ]

步骤2：选择合适的相关计算方法

• 对于初步探索，可以从Spearman相关开始，速度快，易于理解。
• 对于更严谨的分析，特别是打算发表的文章，建议使用SparCC或SPIEC-EASI等方法。
• 如果数据经过适当的转换（如CLR变换）后近似正态，也可以考虑Pearson相关。

步骤3：显著性检验与多重校正

• 计算出的相关系数只是一个估计值，必须进行显著性检验（如通过置换检验得到p值）。
• 最关键的一步：多重检验校正。对于一个有M个物种的网络，我们需要检验 M*(M-1)/2 对关系。如果不校正，假阳性关联的数量将爆炸式增长。必须使用FDR（错误发现率）方法进行校正，如Benjamini-Hochberg。

  # 假设 cor_matrix 是相关矩阵， p_matrix 是原始的p值矩阵 # 将p值矩阵展平、校正、再还原为矩阵是一个常见操作 p_adjusted <- p.adjust(as.vector(p_matrix), method = "BH") p_adj_matrix <- matrix(p_adjusted, nrow=nrow(p_matrix)) # 然后根据校正后的p值矩阵和相关系数矩阵，确定最终的边（例如， |r| > 0.6 & p.adj < 0.05）

步骤4：网络构建与属性计算

• 将满足阈值（如 |r| > 0.7, p.adj < 0.01）的物种对定义为边，构建网络图。
• 使用igraph等包计算网络属性：节点度、介数中心性、紧密中心性、模块化等，识别关键物种（如枢纽物种）。

步骤5：稳健性评估与生物学解释

• 不要过度解读单一网络：相关不等于因果，甚至不等于直接互作。网络结果高度依赖于预处理、方法选择和参数阈值。
• 进行敏感性分析：尝试不同的过滤阈值、不同的相关计算方法、不同的显著性阈值，观察网络的核心结构（如高度连接的节点）是否稳定。
• 结合生物学知识：将网络中的关键模块、枢纽物种与已知的代谢互养关系、环境偏好等结合，提出合理的生物学假设，并通过实验或其他数据验证。

核心提醒：相关性网络的“不可靠性”微生物相关性网络是探索性工具，而非结论性工具。它生成的是“假设”，而非“证明”。我见过太多研究将网络图作为主要卖点，却未对其稳健性进行任何评估。一个黄金法则是：网络中至少70%以上的边应对方法学和参数选择保持相对稳定，否则其生物学意义值得怀疑。在报告中，务必详细说明数据过滤标准、所用方法、显著性阈值和校正方法，并坦诚其探索性本质。