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摘要：杂交瘤HAT筛选常出现集落稀疏、细胞存活差的问题，成因覆盖细胞、培养基、操作等多个环节。本文区分两个发生阶段，梳理排查要点与验证方法，为单克隆抗体制备实验提供参考。

关键词：杂交瘤、HAT筛选、促杂交瘤生长剂、杂交瘤细胞、集落生长不良、HGPRT缺陷、PEG细胞融合、骨髓瘤细胞、饲养层、单克隆抗体、杂交瘤生长剂

杂交瘤细胞融合后经HAT选择培养获得阳性克隆，是单克隆抗体制备的关键环节。实验中常出现筛选后孔内集落稀疏、甚至无细胞存活的情况，导致实验周期延长与试剂耗材损耗。

该类问题的成因涉及细胞、培养基、操作等多个环节，准确排查需要按发生阶段逐步定位。本文整理了不同阶段的常见原因与对应排查方法，供实验参考。

一、杂交瘤细胞生长不良的两种发生阶段

根据出现时间与表现，可分为融合后早期存活失败与筛选期集落消退两类，二者常见原因与排查方向不同。准确区分发生阶段是定位原因的前提，建议融合后24h进行镜检，记录细胞存活状态、细胞碎片比例，作为后续分析的基线依据。

新融合的杂交瘤细胞同时具备B细胞抗体分泌能力与骨髓瘤细胞持续增殖能力，但刚完成融合的细胞稳定性相对较差，对培养环境较为敏感，因此筛选阶段整体存活率通常低于已经适应培养的成熟杂交瘤细胞。

二、集落生长不良的排查要点

1. 融合效率验证

细胞融合本身属于低效率事件，而且对参数高度敏感。PEG分子量与批次、作用时间与滴加速度、融合时细胞密度与活率以及融合前亲本细胞的生长状态，都可能影响最终融合效率。如果融合以后24~48小时已经出现大量细胞碎片，应优先回顾PEG操作及两类亲本细胞的状态，而不是首先调整后续HAT条件。

验证时可以统计融合后总活细胞数与疑似融合细胞比例，并与历史成功批次进行比较。不建议只通过最终集落数反推融合效率，因为最终集落还同时受到HAT选择、铺板密度和培养支持等多个因素影响，中间阶段细胞状态往往更有助于定位真正问题。

处理时可以尽量固定PEG批号和完整操作时序，将关键步骤纳入标准化SOP；融合前24h确认两类亲本细胞活率，并提前复苏和传代骨髓瘤细胞，使其在融合当天处于较稳定的对数生长期。

2. 骨髓瘤细胞HGPRT缺陷确认

HAT筛选的基本原理依赖骨髓瘤细胞HGPRT，即次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷。氨基蝶呤通过抑制二氢叶酸还原酶DHFR阻断嘌呤和嘧啶的从头合成途径；正常细胞可以利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷通过补救合成途径继续合成DNA，而HGPRT缺陷的骨髓瘤细胞由于嘌呤补救途径受阻，会逐步死亡。

如果骨髓瘤细胞长期连续传代且没有维持相应选择压力，可能出现HGPRT相关表型变化，使部分细胞能够在HAT体系中继续生长并形成“假集落”，未融合骨髓瘤残留也可能出现类似表现。

验证时可以将待验证骨髓瘤细胞单独铺板，在HAT培养基中连续培养10~14天，观察是否仍存在持续生长的细胞。如果能够持续存活，应进一步确认当前细胞群的HGPRT缺陷表型是否稳定。

处理时可以根据实验室已有体系，使用8-氮杂鸟嘌呤或6-硫代鸟嘌呤重新进行相应选择，并建立分级工作细胞库，减少长期连续传代造成的细胞状态漂移。

3. 验证HAT培养基质量

HAT培养体系本身也可能成为筛选失败的原因。氨基蝶呤浓度偏高时，选择压力过强，新融合杂交瘤也可能同步死亡；次黄嘌呤溶解度相对较低，如果配制过程中溶解不充分，实际有效浓度可能低于标称值；筛选后期如果未及时换液，基础培养基营养逐渐消耗，同时代谢废物积累和渗透压发生变化，也会限制细胞生长。胸腺嘧啶脱氧核苷水溶性相对较好，通常较少出现明显溶解不完全问题。

验证时可以选用一株已经确认能够耐受HAT的稳定杂交瘤细胞，在当前待验证培养基中连续培养并绘制生长曲线。这个对照可以帮助区分问题究竟来自培养基，还是来自本次新融合细胞本身。

4. 铺板密度与孔板位置效应

铺板密度过高或过低都可能影响杂交瘤集落形成。密度过低时，单孔中细胞总量较少，细胞自身分泌的促生长因子和代谢支持被进一步稀释，可能不足以支持新融合细胞存活和增殖；铺板密度过高时，则会出现更加明显的营养和空间竞争，也会限制整体生长。

此外，96孔板边缘孔由于蒸发速度通常高于内圈孔，长期培养过程中更容易出现培养液体积和渗透压变化，因此常见边缘孔细胞生长明显弱于中心孔的现象，其中蒸发属于主要影响因素之一。

验证时可以使用同批细胞设置3个铺板密度梯度平行培养，在第7天统计集落数量，同时单独比较边缘孔和中心孔的生长差异。

处理时应将铺板密度纳入标准化操作参数，并尽量保证培养箱湿度。可以将培养板置于带盖透气容器中，并通过无菌水等方式减少局部蒸发；96孔板外圈还可以仅加入PBS或培养基而不铺细胞，或者直接只使用内圈孔完成正式实验。

5. 饲养层有效性评估

饲养层可以为低密度杂交瘤细胞提供细胞因子和代谢支持，从而改善单细胞或低密度条件下的存活率，腹腔巨噬细胞是常用饲养层来源之一。但饲养层本身也会引入新的生物学变量，例如细胞来源、制备状态、灭活程度和批次差异都会影响最终支持效果；如果饲养层制备状态不理想，也可能反过来竞争营养和培养空间。

验证时可以设置“加饲养层、不加饲养层、加入化学成分限定生长补剂”三组平行对照，并确保除支持条件以外的其他实验变量保持一致，特别是杂交瘤铺板密度。

如果对照结果显示饲养层没有带来稳定收益，可以进一步考虑使用化学成分限定的生长补剂替代，减少饲养层制备流程和动物来源批次波动。对于部分克隆筛选流程，还可以根据实验目的考虑甲基纤维素半固体培养，使筛选与物理克隆分离同步进行。

6. 血清与培养基组分波动

胎牛血清天然存在一定批间成分差异，新融合杂交瘤对培养环境变化较为敏感，因此血清批次变化可能直接影响筛选和集落形成。与此同时，培养基中的谷氨酰胺在37℃条件下会持续降解，抗生素浓度如果过高，也可能对处于活跃分裂状态的细胞带来额外压力。

验证血清问题时，可以使用同一批冻存细胞，仅更换不同血清批次进行平行培养，从而比较问题是否直接来自血清。

处理时可以在每批新血清正式用于关键融合实验之前，先进行小规模克隆或杂交瘤生长验证；谷氨酰胺可以现配现加或者使用稳定型衍生物；抗生素按照推荐工作浓度使用，不建议为了提高“保险系数”而随意增加剂量。

7. 操作环节的隐性影响

部分实验操作偏差单独看起来并不严重，但多项误差累积以后可能明显降低杂交瘤存活。例如离心转速偏高或者时间过长、PEG稀释和重悬时吹打过猛、培养箱温度和湿度不稳定、CO₂波动以及频繁开门导致的温度变化，都可能在融合后的高敏感阶段进一步增加细胞压力。

验证时可以直接对照当前失败实验和历史成功批次的操作记录，比较离心、过滤、接种、PEG处理和培养参数差异，并在关键步骤设置平行重复。

这类问题通常更适合通过操作固化和SOP管理解决，而不是简单更换试剂。

三、筛选阶段的生长支持

如果经过上述排查仍然没有发现明确流程问题，可以进一步考虑优化筛选阶段的细胞生长支持条件。

需要区分的是，HAT选择阶段的主要作用来自代谢选择压力，而单细胞或低密度克隆阶段的主要限制是细胞本身在低密度环境下的存活和增殖能力不足，这两类因素彼此独立。HAT决定哪些细胞可以在选择体系中继续存活，而生长支持更多影响已经成功融合的细胞能不能真正扩增形成可见集落。

Hybriboost促杂交瘤细胞生长剂为曼博生物自研化学成分限定配方，可提供细胞增殖相关营养与信号支持，用于改善新融合细胞的抗逆性和低密度增殖能力。公开资料显示其不含动物来源成分和血清蛋白，可与DMEM、RPMI-1640等基础培养基以及HAT筛选体系配合使用，并适用于NS-1、SP2/0等常见小鼠骨髓瘤融合体系。

流程排查用于发现并纠正系统误差，而生长补充剂用于进一步改善细胞本身的存活和增殖能力，二者适用场景不同，更合理的顺序仍然是先排查基础流程，再进行生长支持优化。

四、常见问题说明

Q1：HAT筛选后整块板无细胞存活，是否可以挽救？

如果HAT筛选后完全没有集落形成，并且孔内已经没有可见存活细胞，那么从原板继续恢复的空间通常比较有限。与其持续向原板增加培养基或补剂，更建议先通过小规模平行实验验证融合、HAT和培养支持体系是否稳定，在明确问题以后重新进行正式融合。

Q2：集落数量少但阳性率高，是否需要重做融合？

如果最终集落数量较少，但已经获得的集落中阳性率较高，说明筛选体系本身具有一定有效性，问题更可能集中在存活细胞总量和集落形成效率，而不是选择特异性。此时可以优先调整铺板密度和生长支持条件，提高后续集落形成数量，同时将已经获得的阳性克隆尽早扩增和建库，降低后续培养过程中克隆丢失风险。

Q3：HAT培养基中可以同时添加生长补剂吗？

如果化学成分限定生长补剂与HAT、基础培养基和其他常用成分之间不存在明显配方冲突，可以在目标实验体系中通过平行实验验证联合使用。生长补剂的作用是支持新融合细胞存活和增殖，并不是削弱HAT的选择原理，因此实际使用时仍应保留HAT选择条件并设置适当对照。

Q4：饲养层是否可以省略？

饲养层的主要作用是为低密度细胞提供细胞因子和代谢支持。如果化学成分限定生长补充剂能够在当前体系中达到相近支持效果，则可以通过平行对照实验评估是否有必要继续保留饲养层。建议直接比较“加饲养层、不加饲养层、使用替代生长补剂”三个条件，并保持杂交瘤铺板密度等其他参数一致，再根据集落数和细胞状态决定。

结语

杂交瘤HAT筛选阶段集落生长不良，可以来自亲本细胞、PEG融合、HGPRT表型、HAT培养基、铺板密度、饲养层、血清以及操作条件等多个环节。根据问题出现的时间逐步排查，可以更快定位主要限制因素并进行针对性调整；在排除明显流程误差以后，再结合生长补充剂进一步优化低密度细胞存活和克隆形成，会比单纯反复重做融合更有信息量。

关于技术来源

本文基于公开实验经验及杂交瘤HAT筛选相关技术资料，曼博生物MineBio整理，仅用于科研信息分享和实验参考。Hybriboost为曼博生物自研科研用促杂交瘤细胞生长剂，可用于新融合杂交瘤和低密度克隆的生长支持。实际杂交瘤筛选效果仍受细胞系状态、PEG操作、HAT体系、铺板密度、血清批次和培养环境等多种因素影响，应结合自身实验条件进行预实验和对照验证。