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基于 scientific-agent-skills 的 bulk-rnaseq 技能全解析：从原始 FASTQ 到差异表达与通路富集的端到端可辩护工作流

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导读

本文深度解析 scientific-agent-skills 仓库中的bulk-rnaseq技能。它是一个 bulk RNA-seq（批量转录组）"编排器（orchestrator）"，负责把原始 FASTQ 测序数据串成一条完整、可辩护（defensible）的差异表达研究流水线：FastQC/裁剪 → 比对/定量（STAR/Salmon）→ 基因计数矩阵 → 差异表达（pydeseq2）→ 通路富集（pathway-enrichment）→ 出版级图表。读完本文，你将掌握其两种上游路径的选型与运行方式、samplesheet 校验与计数矩阵桥接脚本的底层实现、实验设计与 QC 关卡的设计逻辑，以及如何将其与仓库内pydeseq2、pathway-enrichment、nextflow、scientific-visualization等技能串联成一条可复现的完整分析链。

技能定位：一个路由编排器，而非重新实现

该技能的元数据（见 skills/bulk-rnaseq/SKILL.md）声明其用途是："拿到 bulk RNA-seq reads 或定量输出，想要一套完整、可复现的差异表达工作流"。其核心设计思想在 Overview 中表达得很清楚：它是一个 router（路由器），不是 reimplementation（重新实现）——流水线中绝大多数环节在仓库中已有专属技能，本技能负责以正确顺序把它们连接起来，并填补唯一的真实空白（原始 reads → 基因级计数矩阵），同时强制执行决定最终结果是否可信的设计与 QC 决策。

技能正文反复强调 "defensible"（可辩护）一词，并把它拆解为三件事：

• 可复现（Reproducible）——锁定流水线/工具版本、尽可能使用容器、记录全部参数、固定随机种子；
• 质量门控（Quality-gated）——QC 在校对前、中、后都要被检查并据此行动，而不是被跳过；
• 统计严谨（Statistically sound）——充足的生物学重复、与生物学匹配的设计、正确处理计数、做 FDR 控制的假设检验。

整条流水线被概括为一句话：FastQC/trim → align/quant (STAR/Salmon) → counts → DE (pydeseq2) → enrichment (pathway-enrichment) → figures。

何时使用该技能

技能文档明确列举了适用场景：

• 从 FASTQ 文件（或一次测序 run）走到差异表达基因与通路；
• 运行或配置nf-core/rnaseq，或使用 STAR、Salmon、featureCounts 做比对/定量；
• 把 Salmon/STAR/featureCounts 输出整理成 PyDESeq2/DESeq2 可直接使用的计数矩阵；
• 在投入计算资源前，设计或 sanity-check 一个 bulk RNA-seq 实验（重复数、批次、链特异性）；
• 为端到端 RNA-seq 分析划定范围并决定串联哪些工具与技能。

边界界定同样清晰：这是bulk（样本 = 生物学样本）RNA-seq；单细胞/单核数据请用scanpy；只做差异表达统计用pydeseq2；只做富集用pathway-enrichment。

流水线总览

技能文档给出的 mermaid 图完整刻画了数据流与两条上游路径：

值得注意的细节是：nf-core/rnaseq路径与独立工具路径最终都收敛到基因级计数矩阵，之后的流程完全一致；虚线连接的各个模块对应仓库中独立的兄弟技能，真正由本技能"自研拥有"的只有build_counts_matrix.py桥接脚本与设计/QC 决策约束。

两条上游路径：二选一并坚持到底

文档用一张决策表让用户按场景选择，并强调两条路径产出等价的基因计数：

当你不确定时，优先 Path A：nf-core/rnaseq已经把 FastQC → 裁剪 → STAR/Salmon → 定量 → tximport → MultiQC 用合理、经评审的默认值串好，是最稳妥可辩护的选择。Path B 的存在是为了透明性与受限环境。

环境搭建（Setup）

技能文档给出三部分安装指引：

# 本技能的胶水代码（桥接 + 交接）—— Python uv pip install pytximport pandas # 下游技能各自安装依赖： # pydeseq2 skill -> uv pip install pydeseq2 # pathway-enrichment skill -> uv pip install gseapy gprofiler-official # Path A (nf-core)：只需 Nextflow + 一个容器引擎——详见 `nextflow` 技能。 # Path B（独立工具）：经 bioconda 安装，为可复现请锁定版本。 conda create -n rnaseq -c bioconda -c conda-forge \ fastqc fastp trim-galore "star=2.7.11b" "salmon=1.10.3" subread multiqc

文档特别强调：必须记录你使用的确切版本（流水线 revision、工具版本、参考基因组 + 注释版本），它们要写进 methods 部分，这是分析可复现性的前提。

快速上手

Path A — nf-core/rnaseq（推荐）

# 0. 先校验 samplesheet（能在早期拦截最常见的失败） python scripts/validate_samplesheet.py --samplesheet samplesheet.csv # 1. 用内置微型数据 smoke-test 环境 nextflow run nf-core/rnaseq -r 3.26.0 -profile test,docker --outdir test_results # 2. 正式运行：锁定 revision，选择 aligner，传 samplesheet + 参考 nextflow run nf-core/rnaseq -r 3.26.0 \ -profile docker \ --input samplesheet.csv \ --genome GRCh38 \ --aligner star_salmon \ --outdir results \ -resume

关键点：nf-core/rnaseq内部已经运行 tximport，所以基因计数输出已经是合并好的——无需再运行本技能的桥接脚本，直接用results/star_salmon/salmon.merged.gene_counts_length_scaled.tsv做 DE 即可。samplesheet 格式、aligner 选择与输出物细节见 upstream-nfcore.md；引擎/HPC/云/容器细节则交给nextflow技能。

Path B — 独立 STAR/Salmon（简化版）

fastqc -o qc/ reads/*.fastq.gz # 1. QC 原始 reads fastp -i s1_R1.fq.gz -I s1_R2.fq.gz \ -o s1_R1.trim.fq.gz -O s1_R2.trim.fq.gz \ --thread 4 -j s1.fastp.json # 2. 裁剪接头/低质量碱基 salmon quant -i salmon_index -l A \ -1 s1_R1.trim.fq.gz -2 s1_R2.trim.fq.gz \ --gcBias --seqBias -p 8 -o quant/s1 # 3. 定量（逐样本）

完整配方（FastQC、fastp/Trim Galore、STAR index + align +--quantMode GeneCounts、Salmon decoy-aware index、featureCounts、链特异性判定）见 upstream-manual.md。

计数 → DE → 富集（两条路径通用）

# Path B 专用：为 PyDESeq2 组装 gene x sample 计数矩阵 + 元数据模板 python scripts/build_counts_matrix.py --from salmon \ --quant-dir quant/ --tx2gene tx2gene.tsv --output-dir counts/ # 然后交接给专属技能： # pydeseq2: counts.csv + metadata.csv -> DE 表 (log2FC, padj, stat) # pathway-enrichment: 按 `stat` 排序（GSEA）或用 padj+|LFC| 命中表（ORA） # scientific-visualization / matplotlib: volcano、MA、heatmap、PCA、富集 dotplot

逐阶段工作流

技能文档要求"从上到下执行、不要跳过设计与 QC 阶段"，每一阶段都明确指出了归属的技能或文件：

1. 设计与 samplesheet。确认每组 ≥3 个生物学重复，识别批次/混杂因素，确定要做的比较。构建 samplesheet 并用scripts/validate_samplesheet.py校验。原理与规则见 design-and-qc.md。
2. 原始 reads QC。逐文件 FastQC，再用 MultiQC 汇总；检查 per-base 质量、接头含量、重复率与过度表达序列；阈值见上述 reference。
3. 裁剪。用fastp或Trim Galore去除接头与低质量尾部，裁剪后重跑 FastQC 确认。配方见 upstream-manual.md（Path A 自动完成）。
4. 比对/定量。STAR（基因组比对 +--quantMode GeneCounts）和/或 Salmon（转录本 quasi-mapping、decoy-aware）。必须确定链特异性（strandedness）——它极易出错且会悄悄砍掉一半计数。
5. 构建计数矩阵。用scripts/build_counts_matrix.py把定量输出转成 gene × sample 整数矩阵与元数据模板。估计计数与基因 ID 映射的细微差别见 counts-and-handoff.md。
6. 差异表达 →pydeseq2技能。载入counts.csv+metadata.csv，设定 design（如~batch + condition），拟合并做 FDR 控制的检验；用 PCA 与 p-value 直方图作为 QC。
7. 富集 →pathway-enrichment技能。GSEA 用全量基因表按 DESeq2stat排序；ORA 传阈值化命中表（padj < 0.05，可选 |log2FC| > 1）。先做基因 ID → symbol 映射。
8. 出图 →scientific-visualization技能。Volcano、MA、样本距离热图、PCA、富集 dotplot，外加作为 QC 叙事的 MultiQC 报告。

samplesheet 校验器：贵在"早"，贵在 error/warning 分界

scripts/validate_samplesheet.py（源码）是本技能两个真实可执行脚本之一，位于昂贵流水线运行的门前。它校验的是 nf-core/rnaseq 风格的四列 samplesheet：

sample,fastq_1,fastq_2,strandedness CONTROL_REP1,/data/ctrl1_R1.fastq.gz,/data/ctrl1_R2.fastq.gz,auto CONTROL_REP2,/data/ctrl2_R1.fastq.gz,/data/ctrl2_R2.fastq.gz,auto TREATED_REP1,/data/trt1_R1.fastq.gz,/data/trt1_R2.fastq.gz,auto TREATED_REP2,/data/trt1_R1.fastq.gz,,auto

从源码看（validate_samplesheet.py中Report类与各校验函数），它的产品本质是error（致命）与 warning（建议）的严格分界——这在仓库测试 tests/bulk-rnaseq/test_scripts.py 中被反复钉死。主要检查点如下：

• 必填列：sample与fastq_1；缺了直接报错。
• 空单元格：带行号的 error（如row 2: empty 'sample'）。
• 文件路径：fastq_1 == fastq_2报错（同一文件被当成双端会悄悄砍半文库）；同一 R1 文件被多行复用报错；s3://、gs://等远端 URL 只 warning 不检查存在性（REMOTE_PREFIXES）；本地文件缺失报错；非常规扩展名仅 warning。
• strandedness：仅接受{auto, forward, reverse, unstranded}（源码常量VALID_STRANDEDNESS），大小写不敏感；缺列只给 advisory warning（nf-core 推荐填auto）。
• lane 合并语义：同一sample占多行会被 lane-merge，只 warning 不失败；但同一样本混用双端/单端行是 error。
• 元数据设计检查（--metadata开启）：样本在 samplesheet 但缺于 metadata 是 error；某组只有 1 个重复（无法估计组内方差）是 error，2 个重复会 warning（推荐 ≥--min-replicates，默认 3）；batch 与 condition 完全嵌套（每个 batch 只含单一 condition）会被 flag 为 confounded。

退出码语义：0 = 无 error（允许 warning），1 = 存在 error，方便直接接入 CI 或流水线前置检查。测试 test_scripts.py 用GOOD_SHEET/GOOD_METADATA及其反例逐条验证了上述 error/warning 分界，例如test_a_singleton_group_cannot_estimate_variance_and_is_fatal与test_batch_fully_nested_in_condition_is_flagged_as_confounded。

counts → DE 桥接：本技能真正的"自留地"

这是整条链中唯一没有上下游技能覆盖的环节，因而由本技能亲自拥有。scripts/build_counts_matrix.py（源码）把上游定量输出转换成pydeseq2技能期望的确切格式，支持三种输入源：

Salmon → 基因计数（经 pytximport）

Salmon 是转录本水平的，需要用pytximport（tximport 的 Python 移植）聚合到基因。技能文档给出底层调用示例：

from pytximport import tximport quant_files = ["quant/s1/quant.sf", "quant/s2/quant.sf", "quant/s3/quant.sf"] txi = tximport( quant_files, data_type="salmon", transcript_gene_map="tx2gene.tsv", # columns: transcript_id, gene_id counts_from_abundance="length_scaled_tpm", output_type="xarray", ignore_transcript_version=True, # 去掉 .N 的 Ensembl 版本后缀 )

counts_from_abundance="length_scaled_tpm"是基因水平 DE 的正确选择——它校正了样本间差异转录本长度/使用，产出的计数可直接喂养后续模型。脚本build_from_salmon（源码第 56-98 行）逐样本发现quant_dir/*/quant.sf，用tx2gene做 transcript→gene 映射（源码默认经output_type="anndata"+.to_df().T转成 gene × sample 方向），round 为整数，列名取样本目录名。

tx2gene 表（transcript_id → gene_id 两列）的来源选项：pytximport.utils.create_transcript_gene_map(species="human")；或直接从注释 GTF 提取（最权威，与定量参考严格对应）：

awk -F'\t' '$3=="transcript"{ match($9,/transcript_id "([^"]+)"/,t); match($9,/gene_id "([^"]+)"/,g); print t[1]"\t"g[1] }' \ annotation.gtf | sort -u | sed '1i transcript_id\tgene_id' > tx2gene.tsv

nf-core/rnaseq 会把实际使用的 tx2gene 写进输出，Path A 可直接复用。

STAR → 基因计数（ReadsPerGene）

每个*.ReadsPerGene.out.tab有 4 列：gene_id、unstranded、forward-strand、reverse-strand。源码常量给出对应关系STAR_STRAND_COL = {"unstranded": 1, "forward": 2, "reverse": 3}，并且build_from_star（第 101-118 行）会跳过前 4 行汇总统计（N_unmapped、N_multimapping…）——测试test_star_summary_rows_are_excluded_from_the_gene_matrix明确验证了这一点，因为把这些行当基因会膨胀每个样本的文库规模。某样本缺失的基因会被fillna(0)补成 0 而非 NaN。这类计数本身已是整数。

featureCounts → 基因计数

featureCounts写一个含#命令行注释头与Geneid, Chr, Start, End, Strand, Length, <bam1>, <bam2>, …列的单矩阵。build_from_featurecounts（第 121-136 行）用comment="#"跳过命令行头，只保留Geneid+ 各 BAM 计数列并重命名为样本 ID（测试test_featurecounts_output_is_reduced_to_genes_by_samples验证注释列不会混入样本）。

方向（orientation）约定

PyDESeq2 最终需要samples × genes。技能约定counts.csv写成genes × samples（与 Salmon/STAR/featureCounts 及 nf-core 输出一致），交由pydeseq2技能的加载器用.T转置——不要转两次。这是文档专门用一节强调的易错点。

估计计数/整数这一微妙点

PyDESeq2 要求整数计数：STAR 与 featureCounts 天然是整数；Salmon/RSEM 给的是估计（小数）计数。本技能的做法是使用length_scaled_tpm后round 到最近整数。由于长度缩放计数中已折叠了文库大小与转录本长度信息，round 后当作计数处理是基因水平 DE 上成熟、可辩护的近似。而 R 路线的"正统"做法（tximport→DESeqDataSetFromTximport）是导入原始计数外加每条基因的平均转录本长度 offset，让 DESeq2 在模型内处理长度；PyDESeq2 不接受该 offset，所以 length-scaled + round 是标准 Python 等价做法，也正是 nf-core 表面暴露给下游的形态。两条路径的共同铁律：绝不把 TPM/FPKM 喂给 DESeq2。

脚本write_outputs（第 139-162 行）还会丢弃全零基因（无信息量，PyDESeq2 会进一步过滤）、写出counts.csv（整数 gene × sample）与metadata_template.csv（每样本一行，含condition=CHANGE_ME与batch占位列），并检测重复样本名。

Path A 场景下的等价操作

在 Path A，流水线已跑完 tximport，upstream-nfcore.md 给出的输出布局为：salmon.merged.gene_counts_length_scaled.tsv（用于 DESeq2）、salmon.merged.gene_tpm.tsv（仅供可视化）、salmon.merged.gene_counts.rds、逐样本 Salmon quant 目录、以及流水线自带的deseq2_qc/PCA 图。交接时只需 pandas 读取并 round：

import pandas as pd df = pd.read_csv("results/star_salmon/salmon.merged.gene_counts_length_scaled.tsv", sep="\t") df = df.drop(columns=[c for c in ["gene_name"] if c in df.columns]).set_index("gene_id") counts = df.round().astype(int) # genes x samples, integer counts.to_csv("counts.csv") # 交给 pydeseq2 技能（它转置为 samples x genes）

链特异性（strandedness）：错设会静默丢一半 reads

上游手册用整节强调它是"最常见的静默灾难"。确定一次，然后所有工具一致应用：Salmon-l A自动检测并在quant/<sample>/lib_format_counts.json报告库类型（ISR= 反向链双端、ISF= 正向、IU/IS= 非链特异）；或用 RSeQCinfer_experiment.py在 STAR BAM 上判定。映射到各工具的参数对照：

Illumina TruSeq Stranded mRNA——最常见的建库试剂盒——是reverse（featureCounts-s 2、STAR col 4）。拿不准就让 Salmon 自动检测，再让其它工具向它对齐。仓库测试 test_scripts.py 中test_the_strand_choice_selects_a_different_column也用同一张表对三个列取值逐一做了断言。

Path B 关键配方速览

独立路径的完整配方（upstream-manual.md）包含：

• 参考数据：用gget ref -w dna,gtf,cdna <species>获取下载链接；genome 与 GTF 必须来自同一 release，并锁定注释版本。
• STAR：建索引用--sjdbOverhang = read length − 1（100 为安全默认），人类需要约 30 GB RAM；比对时加--quantMode GeneCounts与--outSAMtype BAM SortedByCoordinate。
• Salmon decoy-aware index：decoys = 基因组全部序列名，gentrome = transcriptome 拼接在 genome 之前（顺序重要）；-k 31适用于 ≥75 bp 的 reads。定量加--gcBias --seqBias --validateMappings。
• featureCounts：多 BAM 一次传入产出单矩阵，-s语义见上表。
• 汇总 QC：multiqc qc/ star/ quant/ counts/ -o qc/multiqc。

实验设计与 QC 门控：可辩护性的骨架

design-and-qc.md 是该技能"可辩护"主张的理论支柱，核心主张是：下游统计的质量不会超过设计本身。

重复（replication）：要生物学重复（独立样本），不是技术重复（同一文库重测序）；每组 ≥3 是实际最低线，4–6 对典型效应量更稳妥；n=2 时无法可靠估计组内方差，dispersion shrinkage 几乎在唱独角戏。检测 DE 时更多重复胜过更深测序。

深度与布局：~20–30M mapped reads/样本对常规基因水平 DE 足够；低频基因/新转录本/isoform 层面才需要 50M+。比较组内布局、读长、试剂盒与深度必须保持一致。

混杂——设计的杀手：batch 是跨样本变化的一切技术因素（处理日、lane/flowcell、试剂批次、操作员、RNA 提取批次）。若 batch 与 condition 完全对齐（所有处理组周一处理、对照组周二处理），生物学效应数学上不可恢复，任何分析都救不回来。防御手段：随机化样本到批次的分配，并平衡使每个 batch 含所有 condition；把所有 batch 变量记进 metadata。

design formula（交给 PyDESeq2）：调整变量放前面、关注的变量放最后——~batch + condition；连续协变量~age + condition；交互项（处理效应是否因基因型而异）~genotype + condition + genotype:condition。设计矩阵必须full rank——不能包含与 condition 完全混杂的 batch，pydeseq2会直接报错；用pd.crosstab(metadata.condition, metadata.batch)检查空单元格。

QC 关卡：原始 reads 检查 per-base 质量（主体 ≥Q30）、接头、过度表达序列、GC 双峰（可能污染）、重复率（RNA-seq 高重复属正常）；比对阶段看 STAR uniquely-mapped %（好文库通常 >70–80%，低则怀疑参考错误/污染/RNA 降解）、Salmon mapping rate（通常 >70%）、featureCounts assigned %（低 assigned + 高 unassigned_NoFeatures 通常是链特异性设错）、rRNA 占比；标准 DE 不做去重（RNA-seq 的"重复"多半反映真实高表达；只有 UMI 场景用 UMI 去重，不要坐标去重）。

定量后 QC（信任 DE 之前必做）：PCA（生物学重复是否聚簇？PC1 分离的是 condition 还是 batch？batch 主导 PC1 就必须建模它；明显离群点可能是样本弄混/失败）；样本距离热图/层次聚类（暴露标签错位）。DE 之后看p-value 直方图：良好行为是近似均匀 + 0 附近尖峰（真阳性）；若在 1 附近有峰或呈 U 形，说明设计 misspecified / 批次未建模 / 过滤问题——应修正设计而非轻信基因表。

文档还给出可直接照抄的门禁速查清单：

[ ] >=3 biological replicates per group [ ] batch recorded and NOT confounded with condition [ ] raw FastQC reviewed; adapters trimmed [ ] mapping/assignment rate acceptable; strandedness verified [ ] PCA + sample-distance heatmap inspected; outliers/swaps resolved [ ] design formula full-rank, adjustment vars before variable of interest [ ] p-value histogram sane after DE [ ] versions pinned (pipeline -r, tools, genome+annotation release)

基因 ID 映射与 DE → 富集配方

counts-and-handoff.md 提醒：DESeq2 输出通常以Ensembl gene ID为键（如ENSG00000141510，常带.17版本后缀），而 Enrichr/MSigDB/g:Profiler 库期望gene symbol（人类为大写）。映射不匹配是"什么都没有富集"的头号原因。操作建议：先剥版本后缀ids.str.replace(r"\.\d+$", "", regex=True)，再用gget技能（gget info）、database-lookup、pybiomart或mygene映射；Path A 的gene_name列已给出 symbol，可随gene_id一并保留。DE 阶段可以继续用 Ensembl ID，只对最终基因表做映射。

DE → 富集的交接配方（以pydeseq2产出的deseq2_results.csv为准，列含log2FoldChange、pvalue、padj、stat）：

• GSEA（preranked）——用全量排名基因表，按 Waldstat排序（符号表方向、大小表证据强度，比按 log2FoldChange 排序更稳）；不要先阈值化。
• ORA——用阈值化命中表：padj < 0.05，可选加|log2FoldChange| > 1；建议上下调集分开跑。

pathway-enrichment技能的scripts/run_enrichment.py可直接读取 DESeq2 结果 CSV：

# GSEA：直接从 DE 表出发（自动用 `stat` 构建排序） python ../pathway-enrichment/scripts/run_enrichment.py gsea \ --deseq2 deseq2_results.csv --organism human --outdir enrichment/ --seed 123 # ORA：从 symbol 命中表出发 python ../pathway-enrichment/scripts/run_enrichment.py ora \ --genes sig_symbols.txt --organism human --outdir enrichment/

常见陷阱清单

技能文档总结的九大误区基本覆盖了 bulk RNA-seq 出错与不可复现的根源：

1. 重复数过少——每组 <3 个生物学重复几乎没有功效，dispersion 估计不稳；更多重复胜过更深测序。
2. batch 与 condition 混杂——所有处理样本都在与对照不同的日子/lane 处理，效应不可恢复；要随机化并建模已知批次（~batch + condition）。
3. 链特异性设错——选错 STAR 列或 featureCounts-s/Salmon library type 会静默丢弃约一半 reads；用 Salmon-l A或推断链特异性，并核对 assigned-reads 比例。
4. 把 TPM/FPKM 喂给 DESeq2——DESeq2 需要原始（或长度缩放）计数，绝不是 TPM/FPKM 等归一化值；桥接脚本负责处理。
5. 非整数计数——PyDESeq2 要求整数；Salmon 估计值要 round（脚本已做）。
6. 富集环节基因 ID 不匹配——见上文映射章节。
7. 跳过定量后 QC——信任 DE 前必须看 PCA 与样本距离热图，它们能暴露标签换位、离群点与隐藏批次。
8. 跨样本混用比对工具——所有样本必须用同一工具、版本、参考与参数定量。
9. 版本不锁定——"latest" 流水线/基因组使结果不可复现；钉死-r、工具版本与 genome/annotation release。

与仓库其它技能的集成关系

• 上游执行：nextflow（运行nf-core/rnaseq，即 Path A；HPC/云/容器）。
• 参考数据 / 基因 ID：gget（gget ref拿 genome+GTF，gget info/gget search做 ID 映射）、database-lookup（Ensembl/NCBI）、biopython/pysam（FASTA/BAM 处理）。
• 差异表达：pydeseq2（本技能把计数交接给它的 DE 引擎）。
• 富集：pathway-enrichment（ORA + GSEA）。
• 出图与报告：scientific-visualization、matplotlib、seaborn；scientific-writing负责 methods/results 叙事。
• 相关但有别：scanpy（单细胞）、statistical-analysis（多重检验深度）。

参考文件索引

按需查阅下列自包含文档可获得各环节的深度细节（均为仓库内实际存在的文件）：

• skills/bulk-rnaseq/references/upstream-nfcore.md——Path A：samplesheet 格式、--aligner/--pseudo_aligner选型表、关键参数（--save_reference、--trimmer、--remove_ribo_rna、--extra_salmon_quant_args、--skip_*、--gencode）、salmon.merged.gene_counts*.tsv输出、MultiQC 与交接给pydeseq2的内容。
• skills/bulk-rnaseq/references/upstream-manual.md——Path B：FastQC、fastp/Trim Galore、STAR genome index + alignment +--quantMode GeneCounts、Salmon decoy-aware index +quant、featureCounts、链特异性判定。
• skills/bulk-rnaseq/references/counts-and-handoff.md——把定量输出变成 PyDESeq2 就绪的counts.csv/metadata.csv（pytximport、STAR 列选择、featureCounts）、整数/估计计数微妙点、Ensembl→symbol 映射、DE→富集的 rank/hit-list 配方。
• skills/bulk-rnaseq/references/design-and-qc.md——实验设计（重复、批次、混杂、design formula）与 QC 指标解读（mapping rate、重复率、rRNA、复杂度、PCA/离群点）。

脚本与测试可对照研读：build_counts_matrix.py、validate_samplesheet.py，以及覆盖其核心行为的单元测试 tests/bulk-rnaseq/test_scripts.py。

结语

bulk-rnaseq技能的价值在于把"能跑通"提升到"可辩护"：通过 samplesheet 前置校验把廉价易查的问题挡在昂贵计算之前，通过桥接脚本在 Salmon/STAR/featureCounts 与 PyDESeq2 之间铺平类型与方向的坑，再通过设计与 QC 门控约束让下游统计站得住脚。理解这份技能文档与上述源码细节，你便可以从原始 FASTQ 一路走到差异表达基因和富集通路，产出真正可复现、可信赖的批量转录组分析。

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