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单细胞测序擅长回答“组织里有哪些细胞、这些细胞表达了哪些基因、疾病状态下哪些细胞发生了变化”。但在真实组织中，细胞并不是孤立存在的。尤其是牙周炎这类慢性炎症组织，角化细胞、免疫细胞、血管、成纤维细胞和微生物信号共同处在非常局部的空间界面中。做完单细胞测序后，如果研究者只停留在细胞类型和转录差异层面，很容易知道“哪些细胞可能重要”，却仍然不知道这些细胞究竟位于牙面附近、龈沟区域还是更深层基质，也不知道它们周围聚集的是中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞还是B细胞。PCF超多重免疫荧光的价值，正是在组织原位把单细胞测序提出的候选细胞群和蛋白状态重新放回组织结构中观察。

《Nature Communications》发表的“Single-cell and spatially resolved interactomics of tooth-associated keratinocytes in periodontitis”，这篇牙周炎研究提供了很好的例子。研究者首先整合4个人类牙周单细胞测序数据集，建立了34个样本、105918个细胞的牙周炎单细胞图谱，并重点解析牙齿相关角化细胞，特别是龈沟角化细胞SK和结合上皮角化细胞JK。单细胞测序帮助研究者发现，KRT19高表达的SK/JK并不是普通的上皮屏障细胞，它们在牙周炎中出现分化状态改变，并上调CXCL1、CXCL3、CXCL8、IL1A、IL1B、IL36G等效应因子。换句话说，单细胞测序先提供了一个重要线索：牙周炎中的“结构细胞”可能也在主动参与免疫微环境组织。

但这个线索必须回到组织原位中理解。SK和JK最重要的特征不是单纯表达某个基因，而是它们恰好位于牙面、细菌生物膜和牙周免疫反应交汇的空间界面。文献因此进一步使用33抗体的PCF超多重免疫荧光技术，观察健康和牙周炎样本中SK/JK周围的免疫分布。结果显示，牙周炎组织中存在围上皮免疫灶：先天免疫细胞常常受到空间限制并聚集在JK附近，而SK区域则更容易观察到类似三级淋巴结构的免疫细胞聚集。这类信息不是单细胞测序本身能够直接给出的，因为组织解离会丢失细胞原本的相对位置。

这也解释了为什么做完单细胞测序后还要做PCF。单细胞测序发现SK/JK可能具有免疫调控特征，PCF则可以进一步观察这些SK/JK周围究竟形成了什么样的蛋白层空间微环境。例如，PCF80的80抗体Panel可围绕上皮细胞身份、T细胞状态、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、PD-1、PD-L1、ICOS、HLA-DR、Ki67等指标设计空间观察框架，把“细胞通讯预测”转化为可在组织切片中观察的细胞邻近关系和功能状态分布。对于牙周炎、口腔黏膜炎症、屏障组织慢性炎症等研究，PCF不是重复单细胞测序，而是把单细胞线索转化为组织生态位证据。

因此，单细胞测序和PCF的关系可以理解为“先发现，再定位；先找线索，再看组织”。单细胞测序提供细胞类型、转录状态和候选marker，PCF提供蛋白表达、细胞身份、空间位置和邻域结构。在这篇牙周炎研究中，如果没有单细胞测序，研究者难以系统识别SK/JK的转录状态变化；如果没有空间蛋白成像，也难以解释JK附近免疫抑制微生态位和SK局部TLS样结构的空间差异。对于希望从细胞图谱走向组织原位空间蛋白组学理解的课题，PCF的价值就在于让“细胞清单”变成“组织中的细胞关系图”。

【本文说明】

本文仅为科研技术方法介绍，不涉及疾病诊断、治疗建议、疗效预测、用药指导或临床决策。文中提及研究发现均来自学术文献，相关分析结果需结合更多实验和研究进一步观察与复核，不构成任何医疗意见。

【参考文献】

Easter QT, Fernandes Matuck B, Beldorati Stark G, et al. Single-cell and spatially resolved interactomics of tooth-associated keratinocytes in periodontitis. Nat Commun. 2024;15(1):5016. Published 2024 Jun 14. doi:10.1038/s41467-024-49037-y