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一、背景与问题

在蛋白质相互作用研究中，传统的线性多肽面临两大核心困境：其一，线性肽在生理环境中容易被蛋白酶快速降解，代谢半衰期极短；其二，线性肽缺乏固定的三维构象，难以实现高选择性和高亲和力的结合。

多环肽则通过引入两个或以上的环状结构单元，在分子尺度上实现对肽链构象的精准约束。正如Chen等人在2024年《ChemBioChem》综述中所总结的：多环肽能够提供更高的构象刚性和代谢稳定性，并且在抑制蛋白质-蛋白质相互作用方面展现出显著增强的效力。

二、构建方案详解

方案1：二硫键定向成环

原理：利用肽链中半胱氨酸残基之间的氧化交联，形成分子内二硫键，将线性肽约束为环状构象。

技术细节：

• 在噬菌体多肽库中设计包含多个Cys的随机肽序列
• 利用氧化条件（如空气氧化或谷胱甘肽氧化还原系统）促进二硫键形成
• 厦门大学团队开发的二硫键导向基序（DDMP）策略，通过调控Cys的配对模式实现定向折叠

性能数据：

• 实现了对EphA2蛋白靶标的纳摩尔级亲和力筛选
• 库容量虽受限于约10⁶，但序列空间覆盖效率高

方案2：化学交联剂环化

原理：使用多官能团化学交联剂，同时与肽链中多个半胱氨酸发生反应，一步实现多环化。

关键技术参数：

筛选案例：

• 针对FXIa蛋白酶催化域筛选，成功获得低纳摩尔级抑制剂
• 针对4种不同蛋白靶标（人丝氨酸蛋白酶、炎症标志物、受体蛋白）均筛到纳摩尔结合物

方案3：金属离子介导环化

原理：利用亲硫金属离子（Bi³⁺、As³⁺等）与Cys巯基的配位作用，形成以金属离子为核心的多环肽构象。

关键实验步骤：

1. 在M13噬菌体上展示含3个Cys的随机线性肽库
2. 用Bi³⁺处理使肽链环化
3. 对固定化靶蛋白进行亲和淘选
4. NGS测序分析富集序列
5. 合成候选肽进行亲和力验证

数据对比：

• Bi³⁺环化前（线性肽）：Kd = 39 ± 6 μM
• Bi³⁺环化后（双环肽）：Kd = 0.31 ± 0.04 μM
• 亲和力提升：-126倍

方案4：酶催化环化

原理：利用分选酶A（Sortase A, SrtA）介导的肽连接和环化反应，在噬菌体表面直接实现环化。

关键技术指标：

• 对TEAD4靶标的筛选获得双环肽Kd = 63.9 nM
• 环化后亲和力比非环化肽提高102倍

三、方案选择决策树

需要多环肽配体？ ├─ 靶蛋白三维结构已知 → 优先考虑DDMP定向二硫键策略，可精准设计 ├─ 需要超高库容量 → 选择TBAB化学交联策略，库容可达10¹¹ ├─ 追求操作简便 → Bi³⁺金属介导，一步环化、条件温和 └─ 需要酶相容性修饰 → SrtA酶催化策略

四、总结

噬菌体多肽库构建多环肽的核心技术已经形成完整的工具箱。选择哪种环化策略，需要综合考虑靶蛋白特性、所需库容量、操作便捷性和最终亲和力指标。对于国内生物技术公司的研发团队而言，理解各种环化技术的优势和局限，有助于在项目中做出最优技术决策。

参考文献
[1] Chen F-J et al.,ChemBioChem, 2024, e202400072
[2] Duan Z et al.,Nat Commun, 2024, 15: 51723
[3] He R-N et al.,JACS Lett, 2024
[4] Zhang Y-N et al.,ChemRxiv, 2024
[5] Carle V et al.,PEDS, 2021