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酵母基因功能验证伯远生物酵母基因功能验证

伯远生物是国家级专精特新小巨人企业，农业农村部生物育种重点实验室，牵头多项省部级重大专项，公司科研技术人员500+（硕博占比40%以上），是国内最大植物功能基因研究综合性平台
15年技术沉淀，每年完成功能基因研究数量50000+，长期服务课题组10000+（含清北、复旦、武大、华科等知名高校及所有农业类科研院所），服务头部种业公司客户300余家，涉及四十多个物种（含水稻、玉米、小麦、马铃薯、大豆五大主粮以及禾本科高粱、甘蔗，葫芦科黄瓜、西甜瓜，茄科番茄、辣椒与十字花科等），100多个品种的50多个性状（含抗虫抗病、抗除草剂、品质提升、株型改良等）
各类仪器设备投资超1个亿，高标准恒温繁育基地200+亩

案例展示

案例展示

1、total RNA提取结果

2、mRNA纯化

3、初级文库片段长度与阳性率验证

初级文库：长度范围300-3000 bp，平均长度>1200 bp，阳性率100%

4、初级文库库容量鉴定（库容量＞107）

5、次级文库片段长度与阳性率验证

次级文库：长度范围：650-3000 bp，平均长度>1200 bp，阳性率100%

6、次级文库库容量鉴定（库容量＞107）

背景说明

背景说明

为了研究某种核酸或蛋白与哪些蛋白有相互作用，酵母文库就诞生了。所谓的“库”，顾名思义就是“仓库”，也就是包含所有基因的一个大仓库。我们通过提取被研究物种的总RNA，再分离出mRNA，通过逆转录得到cDNA，之后我们将这些cDNA与AD载体连接，得到了一个AD文库。理论上，这样的酵母库能够表达被研究物种的所有蛋白。后期只需要把待研究的目的基因构建到诱饵载体上就能和这个酵母文库进行筛库实验。我司酵母建库的方法有Gateway和SMART技术，其中以Gateway技术为主。

图 核体系酵母文库构建简要流程。

服务流程

服务流程

需求沟通及确认——材料准备——文库构建——数据整理——实验报告

服务内容及说明

服务内容及说明

我司酵母建库的方法有Gateway技术和SMART技术，其中以Gateway技术为主。

（1）文库构建技术方法

基于Gateway技术进行酵母文库构建原理：

基于SMART技术进行酵母文库构建原理：

（2）不同酵母建库技术的比较

（3）不同酵母建库技术交付标准及交付结果

我司酵母建库的方法有Gateway技术和SMART技术，其中以Gateway技术为主，以下主要介绍Gateway技术。

Gateway技术优势

1.初始RNA量大，大大提高cDNA基因覆盖度；

2.需mRNA分离，降低后期其他类型RNA对反转录的干扰；

3.无需进行多循环的PCR扩增放大，大大降低基因的冗余率；

4.体外Gateway重组后电转化大肠杆菌，更稳定，效率更高，而不是原始的以及线性化载体在大肠杆菌体内重组。

Gateway建库产品优势

1.严谨的实验过程；

2.对得到实验结果精益求精；

3.严格的质控，文库质量可靠；

4.完善的售后服务。

Gateway建库主要实验步骤及周期

材料要求

针对每个文库，客户需提供至少能提取500 μg总RNA的新鲜样本，尽量多准备些，暂不接受RNA样本。具体要求如下：

酵母建库样品接收标准

注：

1.对于样品，客户可根据自己的实验目的选取材料的部位和时期，可以是某一时期的某一部位样品，也可以是某一时期的整个植株样品，具体需要依据实验目的而定；一般不同处理条件下的材料需要分别建库，如果客户要求混合建库也是可以的。

2.我司酵母建库目前一般默认Gateway方法，当然如果提供的实验材料有限，不足以用Gateway技术时，我司还有SMART技术建库可供选择。

共享文库

目前伯远生物已完成数千个各类文库构建，拥有丰富的文库构建经验。如果客户有酵母筛库业务相关需求的话，我司可以免费为您提供相关物种的酵母文库进行筛库，无需重复构建，提供一站式服务。因为种类比较多，就没有一一列举出来，如果客户研究的是其它物种的，欢迎打电话（400-027-0273）进行咨询哦！

部分共享酵母文库信息

客户下单及项目信息填写

1.客户按照提示填写项目名称、选择项目类型、填写个人信息及联系方式进行提交；

2.提交项目所需要的具体信息，包括：

（1）已知的材料品种与组织信息；

（2）文库构建类型（核文库/膜文库）；

（3）如果有特殊要求请在备注中注明。

3.文库构建材料：用于提取total RNA的组织材料，尽量多准备些，暂不接受RNA样本；

实验信息

实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户，并发送实验报告查看地址。实验结题后，实验报告，检测结果可在线查看或打印，并永久保留。

实验流程

实验流程

一、实验技术流程

1、Total RNA的提取

1）取适量组织样品，在预冷的研钵中用液氮研成粉末，然后转入RNase free离心管中；

2）加入20mL的CTAB试剂，加入600μL巯基乙醇，振荡混匀，65℃静置30min充分裂解，每10min震荡一次；

3）加入4mL的氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5-10min；

4）8000×g，4℃，离心15-20min；

5）取上清至新RNase free离心管中，加入1/3体积5M氯化锂，颠倒混匀，4℃静置过夜；

6）12000×g，4℃，离心15min；

7）弃上清，加入5mL的75%乙醇（RNase free）洗涤沉淀，12000×g高速冷冻离心 5min；

8）重复步骤7）一次

9）弃上清，超净工作台中干燥RNA沉淀，然后溶解于适量DEPC水中。

2、mRNA分离

1）取上一步骤中提取的total RNA, 冰上融化放置；

2）取500μL Binding buffer B6（与RNA等体积）于65℃水浴预热；

3）小心用移液器轻轻混匀Fasttrack MAG beads, 吸取200μL beads到1.5mL RNase free离心管中；

4）将含有MAG beads的离心管放置在磁座上，静置1min，用移液器吸去上清（避免碰触MAG beads）；

5）将离心管从磁座上取下，马上加入500μL Wash buffer W7, 小心混匀；

6）将离心管放置在磁座上，静置1min，用移液器吸去上清（避免碰触MAG beads）；

7）重复步骤5）- 6）一次；

8）将离心管从磁座上取下，加入预热的Binding buffer B6和total RNA，小心混匀后65℃水浴孵育5min；

9）室温旋转颠倒混匀样品离心管10min；

10）将样品离心管放置在磁座上，静置1min，用移液器吸去上清；

11）重复步骤5）- 6）四次；

12）将洗涤过四次的Beads管从磁座上取下，加200μL DEPC水，小心混匀，37℃水浴2min；

13）将离心管放置在磁座上，静置1min，小心吸取上清至一个新的1.5mL离心管中（RNase free）；

14）重新在Beads管中加入100μL DEPC水，从磁座上取下，小心混匀后放置到磁座上；

15）静置1min后，小心吸取上清置于步骤13）的离心管中，将两次洗脱溶液合并，即样品的mRNA。

3、cDNA初级文库构建

1）片段和接头设计：参考参考《GATEWAY™ Cloning Technology》进行设计；

2）扩增引物设计；

3）cDNA第一链的合成；

4）cDNA第二链的合成；

5）cDNA adapter的制备；

6）cDNA与attB1重组接头连接（三份接头各连一份）；

7）cDNA分级分离；

8）BP重组；

9）电转化大肠杆菌DH10B；

10）文库克隆检测。

4、pGADT7酵母文库的构建

1）初级文库的质粒抽提；

2）文库质粒重组；

3）酵母文库质量鉴定。

a、库容量的鉴定；

b、重组率；

c、插入片段长度鉴定。

二、实验重难点

相比于SMART建库，Gateway建库对RNA起始量要求较高。

三、与其他同类型实验相比优势与劣势

酵母文库可以多次使用，同一物种的酵母文库可以用于不同的转基因筛选。不过对于亚细胞定位尚不明确的诱饵蛋白，需要明确其具体定位后，才能选择合适的酵母文库。

四、我司该实验业务优势

1、初始RNA量大，大大提高cDNA基因覆盖度；

2、分离mRNA为模板，可避免rRNA或残留基因组对一链合成的影响；

3、mRNA反转录，可获得完整的基因信息，避免冗余，避免了PCR扩增可能产生的基因偏好性；

4、Gateway重组法的高效性，较其它重组法优势非常明显；

5、Gateway文库可以重复使用次数是SMART技术10-20倍；

6、体外gateway重组后电转化大肠杆菌，更稳定，效率更高，而不是原始的以及线性化载体在大肠杆菌体内重组。

五、常见问题答疑

1、对于膜体系酵母文库和核体系酵母文库，该如何选择？

A：对于亚细胞定位显示定位在细胞核的蛋白，选择核体系文库；对于定位在细胞膜的蛋白，则选择膜体系文库；对于定位在细胞质的蛋白，可以选择核体系文库或膜体系文库。

2、膜体系酵母文库和核体系酵母文库在构建上有什么区别？

A：两者在初级文库构建上都是通过BP重组至pDONR222载体并电转化DH10B感受态；不过在次级文库构建上，核体系文库是通过LR重组至pGADT7-GW载体并电转化DH10B感受态，而膜体系文库是通过LR重组至pPR3-N载体并电转化DH10B感受态。

3、有关总RNA的吸光度各自代表什么？

A：260nm、340nm、230nm、280nm吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。

OD260/OD280体现了提取的RNA中蛋白质等有机物的污染程度。质量较好的RNA的OD260/OD280比值应该在1.8到2.2之间。如OD260/OD280小于1.8，则说明RNA中蛋白质等有机物的污染较多；如OD260/OD280大于2.2，则说明RNA已经降解成了单核苷酸。

OD260/OD230则体现了提取的RNA中盐离子或多糖的污染程度。质量较好的RNA的OD260/OD230比值应该在2.0左右。如OD260/OD230的比值小于1.0则说明RNA中仍残留大量多糖或盐离子污染。多糖的污染会影响OD260的吸收，从而导致RNA的浓度测定不准。残留的盐离子则可通过75%乙醇洗涤去除。

酵母基因功能验证通常以敲除/敲低、异源功能互补、过表达和互作验证为主，最常见的是先看表型变化，再用回补或互作实验把功能证实起来。
常用验证路线
基因敲除后看表型：构建单基因缺失株，观察生长速度、细胞形态、营养缺陷、胁迫耐受或代谢变化。酵母基因功能验证
异源功能互补：把候选基因导入已知缺陷的酵母突变株中，看能否恢复生长或其他表型，这是功能验证里证据很强的一类方法。
过表达验证：提高目标基因表达量，观察是否增强、削弱或改变相关表型。
机制补充实验：酵母双杂交、单杂交、膜蛋白互补或荧光互补等，可用于验证蛋白互作或蛋白-DNA调控关系。
酵母基因功能验证典型实验流程
克隆目标基因，构建敲除、过表达或互补载体。
酵母基因功能验证转化酵母并筛选阳性克隆，通常结合抗性筛选和PCR/测序确认。酵母基因功能验证
做表型测试，包括平板生长、液体生长曲线、温度/盐/氧化胁迫处理或营养缺陷恢复实验。
若要进一步证明机制，再做双杂交、单杂交或相关报告系统。
酵母基因功能验证结果怎么判断
敲除后表型减弱或丢失，提示该基因参与该生物过程。
酵母基因功能验证互补后表型恢复，说明候选基因功能与已知基因一致或高度相关。
互作/调控实验阳性，只能证明存在相互作用或调控关系，最好结合功能表型一起解读。
常见应用场景
营养代谢和离子稳态相关基因功能研究。
酵母基因功能验证细胞周期、细胞形态和应激响应相关基因验证。
转录调控网络、蛋白互作与上游调控元件研究。