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以解牛之法析生信，观微雀之形览科研。

乔粒说：

• 这篇文章最吸引我眼球的就是这张图了：3D核密度地形图：比普通UMAP更能展示两组之间的密度差异，视觉冲击力强，总体上看更像是一副水墨画，符合大多数国人的审美。在后续的推文中我们会试着做一下这张图的教程，让我们的图表更加得吸睛。

让我们先看下这篇文献的大概内容。

本文研究团队来自湖南省人民医院肝胆外科和中央实验室，综合分析528例HCC临床患者数据，结合超百万细胞的单细胞测序公开数据集、空间转录组、组织微阵列（TMA）和鼠模型功能实验，完整重建了这个"免疫治疗增效"背后的分子图谱。

文献标题：HBV-driven expansion of CXCR6⁺-exhausted T cells and CXCL16⁺ macrophage interaction: Implications for immunotherapy in HCC

中文标题：HBV驱动的CXCR6+耗竭T细胞的扩增和CXCL16+巨噬细胞的相互作用:对HCC免疫治疗的启示

DOI：https://doi.org/10.1016/j.xinn.2026.101274

发表时间：2026年1月20日在线发表，2026年6月1日正式出版

发表期刊：The Innovation

影响因子（IF）：39.5

核心生信方法

本研究的方法组合是收藏价值所在：

• 单细胞RNA测序（scRNA-seq）：来自公开数据集PRJCA007744，共纳入来自124例患者、160个样本的1,092,099个细胞，进行系统性细胞类型鉴定和亚群分析
• UMAP + 3D核密度图（Kernel-Density Landscape）：三维密度地形图可视化，立体展示不同病毒背景下细胞分布的差异，这种"地形感"的可视化比普通二维UMAP更具冲击力
• 伪时序分析（Pseudotime analysis）：追踪CD8⁺ T细胞的分化轨迹，揭示HBV感染如何加速T细胞向衰竭末端分化
• 细胞通讯分析（CellChat/Ligand-Receptor分析）：量化CD8⁺ T细胞与巨噬细胞之间的受体-配体互作网络强度
• 空间转录组（Spatial Transcriptomics）：在组织切片上"原位"定位PD-1⁺CXCR6⁺CD8⁺ T细胞与CXCL16⁺巨噬细胞的共定位关系
• 转录因子调控网络分析（Regulon Activity，基于pySCENIC）：鉴定TEX3亚群关键转录因子活性
• TMA + 多色免疫荧光（mIHC）：用90+105例真实HCC患者样本做蛋白层面验证
• 流式细胞术：外周血和肿瘤组织中T细胞亚群频率的定量检测
• 过继T细胞回输（Adoptive T Cell Transfer）小鼠模型：体内功能验证CXCR6⁺ T细胞与PD-1抑制剂联合的增效机制

结果解读

图1 | 研究流程 + 临床生存数据

方法：回顾性收集湖南省人民医院2022-2023年接受免疫治疗的528例HCC患者临床数据，HBV⁺组441例，非HBV组87例，进行Kaplan-Meier生存分析（log-rank检验）。

结果：HBV⁺ HCC患者总生存期显著优于非HBV HCC患者（p=0.034）。CT影像对比显示，HBV⁺组患者免疫治疗后肿瘤明显缩小、活性降低。

收藏点：这张图建立了整篇文章的出发点——528例真实世界患者数据，不是做做样子，是扎实的临床支撑。

图2 | 超百万细胞的免疫微环境全景图

方法：整合公开数据集PRJCA007744（1,092,099个细胞），UMAP降维聚类分为髓系细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞等亚群。使用3D核密度地形图比较HBV⁺与非HBV HCC的细胞密度分布差异；TMA多色免疫荧光（90例HCC患者）和流式细胞术进行独立验证。

结果：HBV⁺ HCC组的CD8⁺ T细胞比例显著高于非HBV组（TMA p<0.001，流式p<0.05）；巨噬细胞比例同样升高。细胞通讯分析发现，HBV⁺组CD8⁺ T细胞与巨噬细胞之间的检查点受体-配体互作（包括PDCD1LG2-PDCD1、CD86-CTLA4等）在数量和强度上均显著增强。多色免疫荧光进一步证明，HBV⁺组CD8⁺与CD68⁺细胞在空间上距离更近（0-20μm范围内共定位更多）。

用CD8⁺和CD68⁺的空间距离分布来量化细胞"互作密切程度"，这比单纯统计细胞比例更有生物学意义，很值得借鉴。

图3 | CD8⁺ T细胞六大亚群画像

方法：单独提取并重聚类CD8⁺ T细胞，基于经典marker基因定义六大亚群：TEM、TEMRA_TEFF、TEX（衰竭）、TN（初始）、THCM（归巢细胞毒性记忆）、TPRO（增殖）。用圆形堆叠图（Circular Plot）展示每位患者CD8⁺亚群构成，按衰竭T细胞比例排序。

结果：在HBV⁺ HCC中，CD8⁺ TEX（PD-1⁺ CD8⁺ T细胞）比例显著高于非HBV HCC组，3D核密度图直观展示了这种富集。免疫组化（30例配对肿瘤及癌旁组织）和多色免疫荧光（TMA，90例）均独立验证：HBV⁺ HCC肿瘤组织中PD-1表达更高，CD8⁺PD-1⁺ T细胞更多。

圆形堆叠图这种可视化方式同时展示患者个体间的异质性和组间趋势差异，一张图传达两层信息，是单细胞文章的经典高颜值图型，值得复用。

图4 | T细胞功能特征打分 + 伪时序轨迹

方法：对CD8⁺ T细胞进行多维功能基因集打分（抑制性、细胞毒性、激活效应、趋化因子受体、TCR信号、代谢等），箱线图展示HBV⁺ vs 非HBV组的差异。使用Monocle3进行伪时序分析，绘制CD8⁺ T细胞从初始→记忆→衰竭的分化轨迹。

结果：HBV⁺组CD8⁺ T细胞在抑制性、衰竭性、细胞毒性、激活效应、趋化因子受体等维度均显著更高（p<0.0001）。关键发现：在HBV⁺ HCC中，CD8⁺ TEX（衰竭T细胞）仍然保留了最高的细胞毒性评分——这说明这群"衰竭"细胞并非真正"死了"，而是处于一种"待激活"状态。伪时序分析揭示，HBV⁺患者的CD8⁺ T细胞更早进入衰竭轨迹且维持时间更长，衰竭过程中趋化因子受体激活更早。

关键一步：伪时序分析既展示了分化轨迹，又揭示了功能特征在时间轴上的变化趋势——这种"动态"视角比静态UMAP更能解释"为什么"。

图5 | 发现新亚群：PD-1⁺CXCR6⁺CD8⁺ T细胞（TEX3）

方法：单独重聚类所有CD8⁺ TEX细胞，识别出7个亚群（TEX0-TEX6）。对各亚群进行细胞毒性打分、伪时序分析、差异基因火山图分析（Volcano Plot）。利用空间转录组数据定位TEX3亚群分布。用流式细胞术、多色免疫荧光（105例接受免疫治疗的HCC患者）和免疫组化验证CXCR6蛋白表达差异。最后，按肿瘤内PD-1⁺CXCR6⁺CD8⁺ T细胞密度中位数分组，进行无进展生存期（PFS）分析。

结果：TEX3亚群细胞毒性评分最高，且处于分化轨迹的较早阶段（尚未完全衰竭）。差异基因分析显示TEX3高度特异性表达CXCR6（一种七次跨膜G蛋白偶联受体）。空间转录组数据证实，在HBV⁺ HCC组织中，PD-1⁺CXCR6⁺ CD8⁺ T细胞富集程度更高。流式、mIHC和免疫组化三重独立验证。临床结局分析：PFS在TEX3-High组（n=53）显著优于TEX3-Low组（n=52），log-rank p=1.1×10⁻¹¹。

** 从七个亚群中"挖"出一个既有杀伤力又能预测免疫治疗预后的特殊亚群，这是单细胞文章能发高分期刊的核心范式——精准亚群定义→多维度功能注释→临床样本独立验证→生存预后关联，四步走。

图6 | 巨噬细胞亚群与免疫微环境互作

方法：使用多色免疫荧光分析HBV⁺ vs 非HBV HCC组织中PD-1⁺CXCR6⁺CD8⁺ T细胞与CD68⁺巨噬细胞的共定位关系。利用空间转录组数据定位CXCL16⁺巨噬细胞。在接受免疫治疗的105例HCC患者中，用多色免疫荧光检测CD68/CD11b/CXCL16三重阳性细胞的比例差异。

结果：HBV⁺ HCC组织中，CD68⁺巨噬细胞与PD-1⁺CXCR6⁺CD8⁺ T细胞的空间距离更近，共定位更频繁。空间转录组显示HBV⁺组CXCL16⁺巨噬细胞密度更高。统计分析证实HBV⁺组CXCL16高表达巨噬细胞比例显著升高（p<0.0001）。

从图2发现CD8⁺与巨噬细胞互作增强→图5发现CXCR6是TEX3的关键标志→图6用CXCL16-CXCR6轴把两者连接起来，解释了"为什么巨噬细胞维持了这群T细胞的存在"。

图7 | 小鼠模型功能验证：CXCR6⁺ T细胞增强PD-1抑制剂效果

方法：NOD-SCID-γ免疫缺陷小鼠皮下种植OVA过表达的HCC肿瘤细胞（1×10⁶）。当肿瘤体积达到约50mm³时，随机分为4组（n=7/组）：①对照T细胞组；②CXCR6过表达T细胞组；③对照T细胞+anti-PD-1组；④CXCR6过表达T细胞+anti-PD-1组。每3天测量肿瘤体积，实验结束时称量肿瘤重量。对肿瘤组织进行CD8/PD-1/CXCR6三重免疫荧光染色，统计三阳性细胞比例。

结果：CXCR6过表达T细胞联合PD-1抑制剂组肿瘤重量（p<0.001）和体积（p<0.001）显著小于其他三组。三重免疫荧光确认，该组肿瘤内PD-1⁺CXCR6⁺CD8⁺三阳性细胞密度最高，而对照T细胞组三阳性细胞密度极低。

讨论 | 这篇文章厉害在哪里

和已有文献相比，这项研究的创新点可以归纳为以下几点：

1. 从"临床悖论"出发，逆向解析
HBV感染状态对HCC免疫治疗的影响在文献中一直存在争议。本文用528例真实世界患者数据明确了HBV⁺ HCC获益更大这一现象，然后层层解析背后的免疫机制，研究逻辑扎实。

2. 发现了一个"双重身份"的T细胞亚群
PD-1⁺CXCR6⁺CD8⁺ T细胞（TEX3）这个亚群在概念上很有趣：它既是"衰竭的"（高PD-1表达），又是"保留杀伤力的"（高细胞毒性评分），还处于分化轨迹的早期（尚未完全耗竭）

3. 完整的验证体系，从硅到碳
scRNA-seq发现→空间转录组定位→TMA多色荧光验证→流式定量→小鼠功能实验，五层验证。

点评 | 乔粒解析

这篇文章最值得学的，其实不是某个具体的分析方法，而是一套"发现问题→定义亚群→多维验证→体内证伪"的研究闭环设计。

从生信角度，有几个具体的技术点可以直接借鉴进自己的分析：

• 3D核密度地形图：比普通UMAP更能展示两组之间的密度差异，视觉冲击力强

• 伪时序功能评分叠加：把分化轨迹和功能评分叠加在同一图上，可以揭示"功能状态如何随分化时间演变"

• T细胞亚群再聚类：先做大类，再在感兴趣的亚群内部深挖，是发现新亚群的常规策略

• TCGA生存分析作为补充：用公开数据库的基因表达-生存关系数据辅助支撑发现，成本低、说服力强

  整体而言，这篇文章是单细胞+空间转录组+临床样本验证组合的标准示范文章，很适合作为自己组设计高分文章时的参考框架。

乔粒科研工坊 · 以解牛之法析生信，观微雀之形览科研

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