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摘要

血清样本广泛应用于代谢组学研究，采集后通常于-80℃保存，因此冻存血清的解冻是样本制备前不可避免的分析前步骤，可能影响代谢组数据质量与生物标志物发现。既往研究关于解冻的影响报道不一，主要源于分析平台、代谢组覆盖范围、定量准确度、样本量与研究设计的差异。直接评估解冻对生物标志物发现的影响仍较为缺乏。本研究采用高性能化学同位素标记（CIL）液相色谱-质谱（LC-MS）技术，系统评估室温解冻、4℃解冻、冰浴解冻３种常用血清解冻方案对血清代谢组谱和生物标志物发现的影响。对95例健康个体（54例男性、41例女性）的血清样本在各条件下进行分析。结果显示，３种解冻方法对一小部分代谢物存在统计学显著且可重复的影响，表明解冻条件确实会改变代谢物水平；但相较于个体固有生物学变异，该影响程度轻微。监督建模与其他统计分析表明，包括性别依赖性代谢分离在内的生物学意义模式在所有解冻条件下均稳定保留。上述结果证实，尽管解冻方法会引发可检测的代谢物水平差异，但在研究内部统一使用单一方案时，不会实质性影响生物标志物发现效果。因此，在保持操作一致性的前提下，３种解冻方法均可实际应用，方法选择主要依据实验实操便利性。

deyingchen@zju.edu.cn

Liang.Li@ualberta.ca

#血清代谢组学 #解冻方法 #化学同位素标记 #液相色谱质谱 #代谢组分析 #生物标志物发现

实验

解冻方案与样本制备

图1 评估血清解冻方案对代谢组谱分析和生物标志物发现影响的实验流程总览

将95例健康个体的血清样本分装后于-80℃保存，采用3种不同方法（室温、4℃、冰浴）解冻，经蛋白沉淀、¹²C/¹³C化学同位素标记、LC-MS分析及后续数据处理。

结果与讨论

不同解冻条件下的整体代谢稳定性

图2 不同解冻条件下血清代谢组谱的多变量分析

a 主成分分析（PCA）得分图，展示室温（A）、4℃（B）、冰浴（C）解冻样本的整体分布，质控（QC）样本紧密聚集，表明分析稳定性良好。

b 偏最小2乘判别分析（PLS-DA）得分图，显示3种解冻组存在轻微分离，表明解冻相关影响可检测但程度较小。

c 按解冻条件和性别着色的PLS-DA得分图，证明所有解冻方案下男女样本均呈现清晰且一致的分离。

温度敏感代谢物的分布

图3 解冻相关代谢物的鉴定

a–c 火山图展示解冻方案两两比较的代谢物丰度差异：室温vs 4℃（A vs B）、室温vs冰浴（A vs C）、4℃ vs冰浴（B vs C）。

d 韦恩图总结3种两两比较中显著差异代谢物的重叠情况。

解冻条件下呈单调（阶梯式）趋势的温度相关代谢物

图4 基于肿瘤微环境组成的肿瘤分型

a 从室温解冻（A组）到4℃解冻（B组）再到冰浴解冻（C组）呈渐进性变化的代谢物平均强度热图，数值为各代谢物的组均值。

b 代表性代谢物的箱线图，展示3种解冻条件下的强度分布，证实与a图一致的方向性趋势。

生物学特征完整性与性别相关生物标志物鉴定

图5 不同解冻条件下性别相关代谢物的鉴定

a–c 火山图展示各解冻组内男女样本的代谢物差异丰度：室温（A）、4℃（B）、冰浴（C）。

d 韦恩图总结3种解冻条件下显著性别相关代谢物的重叠情况。

图6 暂定鉴定的性别相关生物标志物在不同解冻条件下的稳定性与诊断性能

a 箱线图展示暂定鉴定的代谢物组氨酰-羟脯氨酸（HPH）和γ-氨基-γ-氰基丁酸异构体（GAC）在室温（A）、4℃（B）、冰浴（C）解冻的男女样本中的分布；2种代谢物均呈现一致的性别差异，且各性别内分布在所有解冻方案下相似。

b 受试者工作特征（ROC）曲线展示各解冻条件下HPH和GAC对性别区分的分类性能，图例中标注曲线下面积（AUC）值。

详细总结

思维导图

实验分组（3种解冻方法）

参考

Comparative Evaluation of Three Serum Thawing Methods and Their Effects on Metabolome Integrity and Biomarker Discovery.

https://doi.org/10.1007/s41664-026-00457-3

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